[發明專利]小鼠抗人CD23單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株

有效

• 申請號: 201210528284.2
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN103289962A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 張林剛;郗日沫;尹芝南
• 申請（專利權）人: 天津三箭生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/28;C12N15/13
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技術領域

本發明涉及以原核表達的CD23蛋白免疫小鼠獲得的分泌CD23單克隆抗體的雜交瘤細胞株1E9，屬于生物工程技術領域。?

背景技術

CD23也稱FcεRII，是人和脊椎動物的IgE低親和力受體，即IgE的II型受體；它是一種廣泛分布于B細胞、嗜酸粒細胞(EOS)、激活的單核/巨噬細胞、血小板、濾泡樹突狀細胞、朗格漢斯細胞(Langhans?Cells)、表皮角細胞、胸腺上皮細胞、部分T細胞、自然殺傷細胞等細胞膜表面的跨膜糖蛋白，分子量為45kDa。?

CD23屬于典型II型穿膜糖蛋白，由321個氨基酸組成，包括由23個氨基酸殘基組成的胞內N-末端、21個氨基酸殘基組成的穿膜區及277個氨基酸殘基組成的的C-末端膜外區；其羧基末端位于細胞外，氨基末端位于細胞內，屬于C型動物凝集素超家族。人CD23基因位于19號染色體上，是單拷貝基因，有兩種類型，由于它們的啟動基因不同造成所編碼的CD23分子氨基末端的6個氨基酸不同，形成了兩種CD23：CD23a和CD23b。CD23a主要在B淋巴細胞和嗜酸性細胞中表達，而CD23b在激活的單核/巨噬細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞、血小板、濾泡樹突狀細胞、朗格漢斯細胞、表皮角細胞、胸腺上皮細胞、部分T細胞、自然殺傷細胞及某些白血病細胞上都有表達。骨髓腔基質來源的巨噬細胞高表達CD23b。細胞膜表面CD23可由自身或被蛋白水解酶裂解為多種大小不等的可溶性片段，稱為可溶性CD23(sCD23)，這些片段大部分仍可與IgE結合，且表現出與IgE無關的多種功能。?

CD23是多功能受體分子/細胞因子，它參與調節IgE的合成、促進B細胞激活、增殖和分化，并通過與膜CD21的結合介導B-T細胞相互作用、增強B細胞向T細胞提呈抗原，促進T細胞成熟。可溶性CD23(sCD23)還可協同IL-1促進胸腺細胞、骨髓前體細胞、生發中心B細胞增殖和分化，抑制單核細胞游走，誘導單核細胞釋放TNF-α、IL-1和IL-6。CD23表達于外周血細胞的某些亞群、B淋巴細胞和EB病毒轉染的B淋巴瘤細胞系，在慢性淋巴細胞白血病和部分中心母細胞淋巴瘤中也有表達；可能通過促進B細胞活化、分化、成熟、防止生發中心B細胞凋亡，使B細胞出現高反應性、合成和分泌自身抗體、引起自身免疫。可溶性CD23(sCD23)與支氣管哮喘關系密切，在細胞間粘附、抗原的呈遞、T和B細胞的活化、IgE合成、哮喘相關基因的轉錄等過程中可能發揮重要作用。?

CD23在免疫系統中有多種功能，在細胞激活與增殖、抗原遞呈及IgE合成等方面都發揮著作用，且CD23在免疫調控、信號轉導及其與疾病的關系等方面起到的重要作用也?越來越受到關注受。?

目前，國內外已經獲得了多種CD23的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優良特性的單克隆抗體。獲得活性高的CD23的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測CD23表達的小鼠抗人CD23單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。?

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：?

(1)根據CD23的基因序列(NM_001207019.2)的編碼框，設計一對特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增CD23基因，構建重組表達載體PET28a-CD23，轉化大腸桿菌BL21感受態，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原。?

(2)采用經典的細胞融合技術制備CD23單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。?

(3)采用免疫組織化學分析CD23單克隆抗體染色人慢性扁桃體炎石蠟切片。?

(4)根據抗體基因的恒定區序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體CD23重鏈可變區和輕鏈可變區，回收目的片段，克隆到pGEM-T載體中，轉化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質粒后測序確定了單克隆抗體CD23的重鏈和輕鏈可變區序列。?