[發明專利]一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210527044.0
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN103045576A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 谷勁松;王革
• 申請（專利權）人: 谷勁松;王革
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;A61K47/48;A61K38/49;A61P7/02
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用，通過戊二醛交聯牛血紅蛋白與瑞替普酶生成PolyHb-rPA復合體，以制備一種具有治療意義的溶栓藥物的方法。

背景技術

瑞替普酶（Reteplase,?r-PA）是治療急性心肌梗死（Acute?myocardial?infarction，AMI）的首選藥物，r-PA是人類組織型纖溶酶原激活物（t-PA）的一部份，與其他溶栓藥物相比，r-PA具有療效顯著，起效迅速，使用方便（可靜脈推注），不良反應小等優點。但目前t-PA價格較高，而且由于其體內半衰期較短（11-19分鐘，重組t-PA約為5分鐘），為維持有效濃度首次靜脈推注后，必須要間隔30分鐘再次注射，給藥方式不當會造成存在出血的危險性，從而限制了r-PA在臨床上的廣泛使用。

發明內容

本發明的目的就是針對上述缺陷而提供一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用，將瑞替普酶（r-PA）與高純度的牛血紅蛋白(Hb)用戊二醛交聯起來，形成PolyHb-rPA復合體。從而有效提高了靜脈推注后r-PA體內的穩定性和半衰期。

本發明的一種PolyHb-rPA復合體及其制備方法和應用技術方案為：一種PolyHb-rPA復合體，該復合體是通過戊二醛交聯血紅蛋白與瑞替普酶生成。

所述的血紅蛋白為牛血紅蛋白。

所述的PolyHb-rPA復合體的制備方法，包括如下操作步驟：

(1)?無基質血紅蛋白的制備：新鮮牛血紅細胞離心分離去除血漿和中層白細胞，于磷酸鉀緩沖液中裂解，溶血液中脂類基質通過甲苯萃取兩次去除，離子交換層析，超濾得到純化的無基質血紅蛋白溶液；

(2)?血紅蛋白與瑞替普酶交聯的多聚PolyHb-r-PA復合體的制備：向純化的血紅蛋白溶液中加入r-PA，血紅蛋白與瑞替普酶的比例（mg/IU）為50~500:1的比例；交聯前將賴氨酸：血紅蛋白以摩爾比10：1加入1.3?M賴氨酸振蕩1小時，然后將戊二醛：血紅蛋白以摩爾比17：l加入0.5?M戊二醛，交聯10-24小時，以HPLC監測分子交聯程度，當達到所需交聯程度后，向溶液中加入2?M賴氨酸溶液終止交聯反應；Lactate?Ringer溶液過夜透析后，通過Sephadex?G-25色譜柱脫除過量的修飾劑和其他的小分子物質；操作過程在4℃，通氮氣保護環境下進行。

步驟（2）中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例（mg/IU）為50:1、100:1、200:1、300:1、400:1或500:1。

步驟（2）中向純化的血紅蛋白溶液中加入瑞替普酶，血紅蛋白與瑞替普酶的比例（mg/IU）為100:1。

一種上述的PolyHb-rPA復合體作為一種溶栓藥物的應用。

本發明的有益效果為：本發明將瑞替普酶（r-PA）與高純度的牛血紅蛋白(Hb)用戊二醛交聯起來，形成PolyHb-rPA復合體。從而有效提高了靜脈推注后r-PA體內的穩定性和半衰期交聯后分子量增大的血紅蛋白可在血紅蛋白濃度較高時仍保持低滲透壓，而且保持了較好的運輸氧的功能，牛血紅蛋白免疫原性低，而且比人血紅蛋白更穩定，并且不需要2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）來調節載氧能力，聚合后其P₅₀值接近天然血紅蛋白。交聯復合物PolyHb-rPA比血液中的紅細胞體積小上百倍，PolyHb-rPA中的血紅蛋白可通過血栓形成初期變得狹窄的毛細血管，給栓塞后的缺血組織供氧。r-PA與血紅蛋白交聯后半衰期延長，增加了降低用藥劑量的可能性，從而降低了出血的風險。

附圖說明

圖1所示為用雙功能試劑戊二醛交聯r-PA與血紅蛋白(Hb)后對r-PA的酶活性的影響；

圖2?所示為大鼠靜脈推注與血紅蛋白(Hb)交聯的r-PA以及未與血紅蛋白(Hb)交聯的r-PA的體內半衰期比較。

具體實施方式：

為了更好地理解本發明，下面用具體實例來詳細說明本發明的技術方案，但是本發明并不局限于此。

在下述實施例中所給出的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。其中所用試劑均有市售。

實施例1：PolyHb-rPA復合體的制備

一、無基質血紅蛋白（Hb）的制備?