[發(fā)明專利]一種分離、檢測黃曲霉的培養(yǎng)基及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210525389.2
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN102978124A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尹燕妮;張承啟;楊倩倩;馬忠華
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/67
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離、檢測黃曲霉的培養(yǎng)基及方法。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黃曲霉(Aspergillus?flavus)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強的一類生物毒素。其中，毒性最強、危害最大的是B1毒素，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被列入嚴管的特劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素既有很強的急性毒性，導(dǎo)致肝臟壞死出血，使免疫系統(tǒng)受損，引起蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良癥并導(dǎo)致兒童發(fā)育受阻；也有明顯的慢性毒性，具有致癌、致畸、致突變作用，對人、家畜的健康威脅極大，因此受到世界范圍的廣泛關(guān)注。

據(jù)世界糧農(nóng)組織估計，世界范圍內(nèi)有25％的農(nóng)作物產(chǎn)品受真菌毒素的污染，其中主要就是黃曲霉毒素。在我國，農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已成為影響食品安全重要隱患之一。2006年，國家疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所對我國部分農(nóng)產(chǎn)品(包括玉米、花生)中黃曲霉毒素污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從江蘇、上海、浙江等九省市采集市售玉米中黃曲霉毒素的檢出率為70.27％，平均含量為36.51μg/kg，最高為1098.36μg/kg，并有14.86％的玉米樣品中B1毒素含量超出國家食品法典限量標(biāo)準(zhǔn)?；ㄉ悬S曲霉毒素的檢出率為24.24％，平均含量為80.27μg/kg，最高為437.09μg/kg，有3.03％的樣品中黃曲霉毒素含量超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

2009年，農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(成都)對全國采集的1013份飼料樣品檢測發(fā)現(xiàn)，99.51％的樣品中檢測出黃曲霉毒素，除山東省91份飼料的黃曲霉毒素B1檢出率為94.51％，其余各省的檢出率均達100％，被檢測樣品中有2.27％的樣品黃曲霉毒素超標(biāo)。2010年中山大學(xué)對310名男生尿液進行檢測發(fā)現(xiàn)90名同學(xué)的尿液中黃曲霉毒素M1呈陽性。

2011年，蒙牛牛奶中黃曲霉毒素M1超標(biāo)，其原因是奶牛在食用霉變的飼料后，原奶中黃曲霉毒素M1超標(biāo)所致?？梢?，控制農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已經(jīng)成為糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中迫切需要解決的重大問題。

由于黃曲霉毒素污染所帶來的巨大經(jīng)濟損失和健康危害，人們一直在努力探求黃曲霉毒素產(chǎn)生機理及防控方法。而研究材料黃曲霉菌株的獲取成為各項研究工作開展的首要前提條件。由于從各類環(huán)境中收集的樣品尤其是土壤中微生物數(shù)量多、種類雜，給黃曲霉的分離帶來較大困難。因此建立一種省時省力、高效專一的從各類樣品中篩選黃曲霉的方法，將會對黃曲霉毒素產(chǎn)生機理及防控的研究有很大幫助。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種分離、檢測黃曲霉的培養(yǎng)基，能高效快速地從土壤或農(nóng)產(chǎn)品中特異分離黃曲霉。

一種分離、檢測黃曲霉的培養(yǎng)基，配方為：酵母提取物8～12g/L、蔗糖8～12g/L、NaCl?75～85g/L、瓊脂25～35g/L、硫酸鹽0.01～0.03g/L、氯硝胺0.01～0.03g/L、抗生素0.05～0.15g/L。

更優(yōu)選的配方為：酵母提取物9～11g/L、蔗糖9～11g/L、NaCl?78～82g/L、瓊脂28～32g/L、硫酸鹽0.015～0.025g/L、氯硝胺0.015～0.025g/L、抗生素0.08～0.12g/L。

所述配方中，酵母提取物和蔗糖為微生物的生長提供必不可少的氮源和碳源。黃曲霉生命力強，生長速度快，酵母提取物和蔗糖已能滿足其生長必需條件。但為了能從各種微生物環(huán)境復(fù)雜的樣品中特異篩選黃曲霉，本發(fā)明在酵母提取物和蔗糖的基礎(chǔ)上添加了一系列添加劑，使培養(yǎng)基具有選擇性，有利于黃曲霉的篩選。所述添加劑為：氯化鈉、抗生素、氯硝胺和硫酸鹽。

篩選過程中，樣品中細菌會影響黃曲霉的生長，而培養(yǎng)基中氯化鈉和抗生素的存在可以有效抑制細菌的生長繁殖。

培養(yǎng)基的滲透壓對細菌生長影響較大，當(dāng)環(huán)境中滲透壓大于胞內(nèi)滲透壓時，細菌就會因失水而停止生長或死亡。由于細菌與真菌細胞壁成分的差異，高濃度的氯化鈉能抑制多種細菌的生長，而對真菌無影響或影響較小。

市售的抗生素種類多樣，本發(fā)明選用鏈霉素。

同樣地，為避免其他生長較快的真菌對黃曲霉分離產(chǎn)生干擾，本發(fā)明的培養(yǎng)基中添加了適量的氯硝胺，氯硝胺能抑制除黃曲霉外大多數(shù)真菌的生長。