[發明專利]一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法

在審

• 申請號: 201210524764.1
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN102978171A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 陳秀荔;趙永貞;陳曉漢;彭敏;李詠梅;楊春玲;何蘋萍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水產研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68;A01K67/033;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 郭平香

1.一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）TSV病毒組織的獲得：將保存的TSV純化病毒粒子按質量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節肌肉處，試驗對蝦30尾，每尾注射10~12μL，注射后對蝦養殖水溫控制在28-30℃，鹽度28‰，持續充氣，每天觀察對蝦狀態，將瀕死對蝦及時收取置于液氮中；

（2）TSV病毒檢測：用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉錄為cDNA，利用此cDNA為模板進行擴增，擴增TSV病毒上下游引物序列為上游引物：5′-TCAATGAGAGCTTGGTCC-3′，下游引物：5′-AAGTAGACAGCCGCGCTT-3′；

（3）TSV病毒液的制備：取2~5g?TSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末，將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入12~30ml的0.01M?的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g?離心15min，將上層清液用0.45μm的濾器過濾，利用步驟（2）所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，-80℃凍存備用；

（4）構建TSV感染模型：將TSV病毒液按10^-(n-2),?10^-(n-1)，?10^-n，10^-(n+1)，10^-(n+2)共5個濃度制備感染液，將隨機挑選的90只對蝦分成6組，進行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時觀察對蝦情況，連續觀察7d，既而確定感染量，確定病毒感染模型。

2.根據權利要求1所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于：所述步驟（4）的n值為感染對蝦后7d內致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數。

3.根據權利要求1或2所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于：所述步驟（2）擴增的體系為12μL?2×Taq?PCR康為試劑，11μL的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各1μL，擴增程序為94℃?3min，?94℃?30s，55℃?40s，72℃?30s，?35個循環，72℃?延伸10min。

4.根據權利要求3所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于：所述步驟（1）試驗對蝦的體重為10~12g。