[發明專利]棉鈴蟲對Cry1Ac 毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質區缺失突變的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201210524000.2
• 申請日: 2012-12-07
• 公開（公告）號: CN103014159A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 吳益東;張浩男;楊亦樺;武淑文
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明涉及生物技術，涉及棉鈴蟲對Cry1Ac毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質區缺失突變的分子檢測方法。?

技術背景

表達Cry1Ac毒素蛋白的轉Bt基因棉花，從1997年開始在我國推廣應用，目前已大規模種植于黃河流域和長江流域棉區，平均占到全國棉花種植面積的75%左右。由于轉基因Bt棉花的大規模推廣應用的高強度選擇壓力導致其靶標害蟲棉鈴蟲（Helicoverpa?armigera）對Cry1Ac毒素產生抗性，是Bt棉花使用中面臨的最大威脅。目前研究表明棉鈴蟲中腸腸壁細胞鈣粘蛋白基因突變是抗性形成的主要原因。鈣粘蛋白是一類對細胞粘結起決定作用的依賴Ca²⁺的糖蛋白，參與多種細胞活動，是由12個重復子的胞外區、跨膜區和較小的胞內區組成。以往發現的基因突變部位均位于鈣粘蛋白胞外區結構域，通過轉座子的插入或片段缺失導致鈣粘蛋白翻譯提前終止，喪失了毒素結合區，從而對Cry1Ac產生抗性，這種功能喪失性突變產生的抗性通常呈隱性。?

2009年利用F1單對檢測法共檢測230頭山東夏津田間棉鈴蟲，檢測到攜帶抗性基因的個體有67頭。根據F1檢測的原理(Zhang等,Diverse?genetic?basis?of?field-evolved?resistance?to?Bt?cotton?in?cotton?bollworm?from?China.PNAS，2012，109(26):10275-10280)，這些抗性個體與室內抗性品系SCD-r1單對雜交(Yang等，Introgression?of?a?disrupted?cadherin?gene?enables?susceptible?Helicoverpa?armigera?to?obtain?resistance?to?Bacillus?thuringiensis?toxin?Cry1Ac.Bulletin?of?Entomological?Research,200,99(2):175-181)，F₁代經診斷劑量（1μg/cm²Cry1Ac）處理存活個體應含有兩個鈣粘蛋白等位基因，一個來自SCD-r1品系（r₁）(Yang等，Identification?and?molecular?detection?of?a?deletion?mutation?responsible?for?a?truncated?casherin?of?Helicoverpa?armigera.Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology,2006,36(9):735-740)，另一個來自田間個體（r_x）。SCD-r1品系的抗性是由鈣粘蛋白突變基因r₁引起的，r₁缺失大部分胞外區和整個跨膜區及胞質區，因此可以通過4組特異性引物選擇性的克隆出田間抗性個體的鈣粘蛋白基因r_x（Zhao等，Diverse?cadherin?mutations?conferring?resistance?to?toxin?Cry1Ac?in?Helicoverpa?arimgera.,2010,40(2):113-118）。克隆了20個田間抗性個體的鈣粘蛋白基因序列，鑒定到1個新的鈣粘蛋白突變基因r₁₅。測序結果表明位于鈣粘蛋白胞質區的第32號外顯子缺失165個堿基，導致其編碼的55個氨基酸發生缺失，這種鈣粘蛋白胞質區突變能夠使Cry1Ac毒力顯著降低，從而導致抗性產生。（見附圖1、見附圖2）。?

多年多點的田間監測表明，雖然棉鈴蟲對Bt棉花的抗性水平沒有明顯上升，但田間對Cry1Ac毒素抗性基因頻率在逐年增加，特別是新發現的非隱性抗性基因頻率增加明顯。目前主要的抗性監測技術包括：劑量對數-死亡機率值法（抗性倍數法）、F1檢測法、F2檢測法、診斷劑量檢測法及分子檢測法。但前面四種抗性監測方法在棉鈴蟲對Bt棉花的抗性監測中都有明顯的缺點，如不能檢測抗性基因類型，難以確定合適的診斷劑量，室內必須有相應抗性品系，成本高，花費時間長等，導致對抗性監測的不準確和延后，嚴重影響后續有效抗性治理的開展和實施。而分子檢測方法可以直接檢測抗性基因型，精確性高，對待測樣本的狀態無要求，對抗性基因顯隱性無要求，具有靈活性和穩定性。?

發明內容