[發明專利]同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物及其擴增方法和用途

無效

• 申請號: 201210523943.3
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN102943118A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 廖芳;郭京澤;劉鵬;羅加鳳;李關榮;黃國明
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司 12101
• 代理人: 朱瑜

1.一種同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物，其特征在于，實現兩種檢疫性真菌病害同步分子檢測的特異引物，序列如下：

向日葵黑莖病菌的特異引物：LLF：TAG?CAT?TGT?TAG?CCG?AGG

LLR：CAG?CCA?GTC?TTC?TAG?CTT?GG

向日葵莖潰瘍病菌的特異引物：DHF：CGA?GAA?ATC?GTC?CGT?GAT

DHR：ATA?CGG?TCG?GAC?AGA?CCA

所述LLF/LLR擴增片段為255bp，DHF/DHR擴增片段為394bp，特異引物用于向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴增。

2.根據權利要求1所述的同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物，其特征在于，還包括檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的通用引物，序列如下：

ITS1：TCC?GTA?GGT?GAA?CCT?GCG?G

ITS4：TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC

所述引物用于向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌菌絲基因組DNA擴增，擴增片段為560—600bp，作為提取和擴增過程的質量監測。

3.一種權利要求1所述的同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物的擴增方法，其特征在于，包括下述的擴增體系和擴增程序：

（1）擴增體系

建立20μL的擴增體系，包括10×Buffer?2.0μL，其中含終濃度為1.5mmol/L的MgCl₂；2.5mmol/L?dNTPs為2.0μL；0.4μL?Taq?DNA聚合酶，濃度5U/μL；濃度為20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次為1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL；余量為雙蒸水；

(2)反應程序

設立反應程序：94℃預變性4min；94℃變性30s，56℃復性20s，72℃延伸30s，40個循環；72℃延伸7min。

4.如權利要求1所述同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物在檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌方面的應用。