[發明專利]豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因及重組巨大芽孢桿菌和應用

有效

• 申請號: 201210523652.4
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103194472A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 張金林;馬立保;胡曉芬
• 申請（專利權）人: 武漢華揚動物藥業有限責任公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/63;C12N1/21;A61K48/00;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/11
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉麗君

技術領域

本發明涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬流行性腹瀉S₁蛋白融合基因以及含有該融合基因的表達載體，本發明進一步涉及含有該表達載體的重組巨大芽孢桿菌菌株以及它們在制備防治豬流行性腹瀉疫苗中的應用，屬于豬流行性腹瀉的防治領域。?

背景技術

豬流行性腹瀉（PEDV）是由冠狀病毒引起豬的一種急性高度接觸性傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，該病在世界范圍內廣泛分布，危害嚴重，給養豬業帶來重大經濟損失。病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗PEDV感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統發揮著不可替代的作用。?

PEDV具有典型的冠狀病毒結構，由4種主要結構蛋白組成，分別為磷酸化的核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）、糖基化的纖突蛋白（S）和小囊膜蛋白（E）其中S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇能夠誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的重要結構蛋白，因此，S蛋白對病毒感染、發揮其致病性和決定宿主細胞親嗜性方面起關鍵作用。PEDV感染具有明顯的嗜腸性，分泌型IgA抗體是保護豬體不受PEDV感染和免于發病的關鍵因素，口服免疫后，在腸液和血清中均可檢出sIgA抗體，而非口服途徑接種則檢測不到sIgA。仔豬可通過初乳獲得母源sIgA，產生對流行性腹瀉的被動免疫保護。?

常規的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治這兩種疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，如滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機體排散病毒、病毒毒力可能返強等，另外必須通過注射途徑免疫。針對豬流行性腹瀉的特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑，但是如何避免胃腸道對抗原的破壞并有效誘導免疫應答成為關鍵。?

發明內容

本發明的目的之一是提供一種豬流行性腹瀉S₁蛋白抗原融合基因及其編碼的蛋白；?

本發明的目的之二是提供含有上述豬流行性腹瀉S₁蛋白抗原融合基因的表達載體；?

本發明的目的之三提供含有上述表達載體的重組宿主菌株。?

為了實現上述目的，本發明一方面提供了一種由PEDV糖蛋白S的S₁抗原位點與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列（CWA_M6）連接得到的融合基因，其多核苷酸序列為SEQID?No.1所示。?

本發明根據Genbank登錄的PEDV全基因序列AF353511，找出編碼S糖蛋白的22-505aa段序列，通過柔性的Linker((GGGGS)₃)將PEDV的S₁抗原位點基因和細胞壁錨定序列（CWA_M6）連接起來，將該序列命名為MLS₁（SEQ?ID?No.1）。考慮到巨大芽孢桿菌密碼子的偏嗜情況，本發明為了提高異源基因在宿主菌中的表達，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子蘇氨酸（ACG）、組氨酸（CAC）、精氨酸（CGG、CGA）、丙氨酸（GCG）和亮氨酸（CTC、CTG）等進行改變。此外，在MLS₁的上游和下游分別引入BglⅡ酶切位點和SphI酶切位點。?

本發明的另一方面是提供由SEQ?ID?No.1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?No.2所示。。?

本發明的又一方面是提供含有所述豬流行性腹瀉S₁蛋白融合基因的表達載體；例如，將本發明SEQ?ID?No.1所示的抗原融合基因與表達載體pHIS1525進行可操作性的連接，得到可以在巨大芽孢桿菌的外表面或其細胞壁表達融合基因的分泌表達載體。?

針對PEDV經黏膜感染和sIgA在抵抗疾病中具有重要作用的特點，本發明構建了表達PEDV?S₁蛋白的重組巨大芽孢桿菌表達系統，作為一種口服疫苗，通過刺激腸道黏膜免疫系統產生的特異性sIgA，達到阻止病原感染的目的。?

由此，本發明的再一方面是提供一株表達豬流行性腹瀉S1蛋白融合基因的重組巨大芽孢桿菌菌株，能夠用其制備成防治豬流行性腹瀉的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。?