[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌的抗原蛋白及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210521551.3
• 申請日: 2010-07-15
• 公開（公告）號: CN102993283A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何正國;李雨慶
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/31;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543;C12R1/32
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是申請?zhí)枮?01010231572.2的分案申請。

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，也涉及到傳染病分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及3種結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白及在制備結(jié)核病診斷檢測試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

動物細(xì)菌性傳染病對人類健康的威脅日益嚴(yán)重，給國民經(jīng)濟和社會穩(wěn)定造成沖擊和影響。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis，結(jié)核病的主要致病菌）是一種嚴(yán)重危害人類健康的病原菌，全世界有三分之一人口攜帶處于潛伏狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌，每年大約有兩百萬人死于結(jié)核病（Raviglione?M?C.TheTB?epidemic?from?1992?to?2002.Tuberculosis?(Edinb),2003,83:4-14.）。近年來，結(jié)核分枝桿菌合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，對人類公共衛(wèi)生事業(yè)的威脅更加嚴(yán)峻。因此，開發(fā)結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的簡單、快速、敏感的診斷技術(shù)，成為當(dāng)前控制結(jié)核病的重要策略和手段。

到目前為止，臨床上結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要是在顯微鏡下直接觀察結(jié)核分枝桿菌的痰涂片法。但是，痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查的靈敏度非常低，臨床上主要還根據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)資料來綜合診斷結(jié)核病。而另一個診斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核桿菌培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，需要耗費大量的時間，同時還需要有高水平的技術(shù)人員操作，限制了其在臨床結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

研究人員利用各種新興的分子生物學(xué)以及現(xiàn)代免疫學(xué)理論和技術(shù)，已經(jīng)開發(fā)出一些有希望的檢測方法，比如快速分枝桿菌全自動培養(yǎng)和檢測、噬菌體生物擴增法和噬菌體生物發(fā)光法、利用DNA或者RNA的擴增技術(shù)、利用新型免疫學(xué)方法等。但是，這些技術(shù)均需要高成本以及高技術(shù)水平的操作人員，限制了它們在低收入國家的推廣的和應(yīng)用，而這些國家的結(jié)核病感染率往往都比較高。

鑒于此，本發(fā)明申請人根據(jù)前期從結(jié)核分枝桿菌基因組序列中篩選得到的三個抗原蛋白編碼基因，將其在大腸桿菌中克隆表達(dá)純化，并進(jìn)一步應(yīng)用于結(jié)核病的體外分子診斷。本發(fā)明建立了一種快速、低成本、易于操作的基于ELISA技術(shù)的結(jié)核病診斷方法，該方法與在中國市場上應(yīng)用較為廣泛使用的兩種同類試劑盒TB-DOT（上海奧普生物醫(yī)藥有限公司）和TB-check-1（法國VEDA?LAB公司）相比，敏感性和特異性都得到了顯著提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，通過分子生物學(xué)技術(shù)和方法，制備三種適用于診斷檢測結(jié)核病的新型結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白，將所述的三種新型抗原蛋白應(yīng)用于結(jié)核病的ELISA診斷檢測。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

申請人前期從結(jié)核分枝桿菌基因組序列中篩選得到三個基因片段，它們能夠強烈的與結(jié)核病人的血清發(fā)生反應(yīng)。它們的核苷酸序列分別如序列表SEQ?ID?NO：1，3，5所示，它們編碼的氨基酸序列分別如序列表SEQ?ID?NO：2，4，6所示。其中從Rv1987基因（NCBI登錄號NP_216503.1，GeneID:885815，基因注釋為可能的幾丁質(zhì)酶）中篩選得到如序列表SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，序列長度為0.429kb，從Rv3807c基因（NCBI登錄號NP_218324.1，GeneID:886134，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白）中篩選得到如序列表SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，序列長度為0.498kb，從Rv3887c基因（NCBI登錄號NP_218404.1，GeneID:886211，基因注釋為可能的保守的跨膜蛋白）中篩選得到如序列表SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，序列長度為1.53kb。申請人通過基因克隆方法，獲得含有這三個抗原蛋白的重組大腸桿菌。然后，在大腸桿菌中表達(dá)純化這三個結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白。最后，利用獲得的抗原蛋白進(jìn)行結(jié)核病的檢測，并與市售的結(jié)核病診斷試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

生物學(xué)試驗表明，本發(fā)明克隆的上述三個基因編碼的抗原蛋白可以作為特異性抗原蛋白應(yīng)用于結(jié)核病的檢測。

在本發(fā)明的實施例中，申請人提供了三種結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的詳細(xì)制備方法，并描述了這三個抗原蛋白在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的優(yōu)點是，操作成本低，并能夠快速、便捷、準(zhǔn)確的檢測結(jié)核病。

本發(fā)明更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《具體實施方式》。

附圖說明

序列表SEQ?ID?NO：1是本發(fā)明克隆的Rv1987基因片段的核苷酸序列。