[發(fā)明專利]非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外三維定向分化的生物反應器

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210520526.3
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103849567A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 馬小軍;劉洋;劉暢;孫廣煒;于煒婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12M3/00
• 分類號: C12M3/00;C12M1/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發(fā)明涉及干細胞及組織工程領域，是一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外三維定向分化的生物反應器。

背景技術

干細胞是具有自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，它能夠向神經(jīng)、心肌、肝、成軟骨等細胞類型分化，是修復體內(nèi)受損組織的理想種子細胞，在細胞治療、外科整形及組織工程等方面具有重要的研究和臨床應用價值。已有研究表明，將干細胞直接植入受損組織時，其修復的效果不理想，并常伴有并發(fā)癥，如心率失常等。這是由于受損組織的微環(huán)境已被破壞，干細胞識別此微環(huán)境的能力下降，定向分化效率降低。另外，由于干細胞可多向分化，直接將其植入體內(nèi)還可能產(chǎn)生腫瘤。因此，干細胞在植入人體之前，應在體外先進行初步定向誘導分化，使其成為定向祖細胞，以提高其在體內(nèi)向受損組織類型繼續(xù)分化的效率，并降低臨床應用的風險。

目前，體外調控干細胞定向分化有兩種模式：1)含有化學試劑、生長因子的條件培養(yǎng)液誘導模式；2)使用成熟體細胞促進干細胞分化的共培養(yǎng)誘導模式。雖然一些化學試劑和外源生長因子等有促進干細胞定向分化的作用，但是單靠有限種類的細胞因子組合難以維持細胞正常的生理功能，并且化學試劑的毒性可能刺激干細胞發(fā)生變異，因此使用條件培養(yǎng)液不僅誘導效果有限，還會增加臨床應用的風險。共培養(yǎng)誘導模式是使用誘導細胞來促進干細胞定向分化，可進一步模擬體內(nèi)多種細胞共存的生長微環(huán)境，獲得的分化細胞具有較高的生理功能。共培養(yǎng)模式可分為直接接觸與非接觸共培養(yǎng)方式。直接接觸共培養(yǎng)方式是將體細胞和干細胞共同培養(yǎng)在同一個體系中，兩者直接接觸，這種方式存在著干細胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等嚴重問題，不能應用于臨床。非接觸共培養(yǎng)方式，如常用的Transwell體系，依靠聚碳酸酯膜等分離膜將兩種細胞分隔開，在同一體系中實現(xiàn)兩種細胞共培養(yǎng)，解決了不同細胞的分離問題。然而，Transwell體系中細胞以二維方式生長，與體內(nèi)細胞真實生長狀況差別較大，大量研究表明體外二維培養(yǎng)體系使得細胞丟失其在體內(nèi)具有的正常生物學性狀，而體外三維培養(yǎng)則較好地維持了細胞功能。另外，Transwell體系基于為24孔板或6孔板，體系規(guī)模很小，價格昂貴，半透膜的作用面積有限，內(nèi)部缺乏流體流動，存在嚴重的物質濃度梯度，這使得現(xiàn)有的Transwell體系在規(guī)模、效率以及成本等方面均不能滿足未來臨床應用的大量需求。因此，急需研發(fā)一種便捷實用的、低成本的、可規(guī)模化操作的非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外三維定向分化的生物反應器，以實現(xiàn)調控干細胞體外三維定向分化的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸共培養(yǎng)誘導干細胞體外三維定向分化的生物反應器，其既能促進干細胞在三維條件下向誘導細胞類型體外定向分化，同時也實現(xiàn)了誘導細胞的去除以及分化細胞的收獲。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

所述生物反應器為一用于細胞培養(yǎng)的容器，于容器中設有一個或二個以上的分隔網(wǎng)，將容器分隔成二個以上的腔室；包埋有誘導細胞的海藻酸鈉微膠囊和包埋有干細胞的海藻酸鈣微膠珠分別置于不同的腔室中，從而在同一體系中實現(xiàn)了兩種或兩種以上細胞在三維生長條件下的非接觸動態(tài)共培養(yǎng)；該反應器通過微膠囊內(nèi)誘導細胞分泌的誘導因子促進干細胞在三維條件下的定向分化；在分化結束后，可獲得含有分化細胞的微膠珠，利用檸檬酸鈉溶液溶解該微膠珠，最后可獲得分化細胞。

所述分隔網(wǎng)的材質包括金屬或非金屬；

金屬包括碳素鋼、或包含鐵、鋅、錳、銅、鎳、銀元素中一種或二種以上的合金鋼；

非金屬包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚酯樹脂、或聚甲基丙烯酸甲酯；

分隔網(wǎng)的目數(shù)范圍從10到100。

所述干細胞包括胚胎干細胞、iPS細胞、或間充質干細胞，誘導細胞包括體細胞或細胞系；

干細胞和誘導細胞可以是同源同種細胞、同源異種細胞、異源異種細胞；

調控干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導細胞包括神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、髓鞘細胞、或神經(jīng)組織來源的腫瘤細胞系；

調控干細胞向心肌細胞分化的誘導細胞包括；原代心肌細胞或心肌細胞系；

調控干細胞向肝細胞分化的誘導細胞包括原代肝實質細胞、原代內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞系、肝星狀細胞、成纖維細胞、3T3細胞系、或肝組織來源的腫瘤細胞系；

調控干細胞向胰島細胞分化的誘導細胞包括原代胰島或β-胰島細胞；

調控干細胞向成骨細胞分化的誘導細胞包括原代成骨細胞或骨組織來源的腫瘤細胞系；

調控干細胞向軟骨細胞分化的誘導細胞包括原代軟骨細胞或軟骨細胞系；