[發(fā)明專利]非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)干細(xì)胞體外三維定向分化的生物反應(yīng)器

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210520526.3
• 申請(qǐng)日: 2012-12-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103849567A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬小軍;劉洋;劉暢;孫廣煒;于煒婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12M3/00
• 分類號(hào): C12M3/00;C12M1/04
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞及組織工程領(lǐng)域，是一種非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)干細(xì)胞體外三維定向分化的生物反應(yīng)器。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，它能夠向神經(jīng)、心肌、肝、成軟骨等細(xì)胞類型分化，是修復(fù)體內(nèi)受損組織的理想種子細(xì)胞，在細(xì)胞治療、外科整形及組織工程等方面具有重要的研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，將干細(xì)胞直接植入受損組織時(shí)，其修復(fù)的效果不理想，并常伴有并發(fā)癥，如心率失常等。這是由于受損組織的微環(huán)境已被破壞，干細(xì)胞識(shí)別此微環(huán)境的能力下降，定向分化效率降低。另外，由于干細(xì)胞可多向分化，直接將其植入體內(nèi)還可能產(chǎn)生腫瘤。因此，干細(xì)胞在植入人體之前，應(yīng)在體外先進(jìn)行初步定向誘導(dǎo)分化，使其成為定向祖細(xì)胞，以提高其在體內(nèi)向受損組織類型繼續(xù)分化的效率，并降低臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，體外調(diào)控干細(xì)胞定向分化有兩種模式：1)含有化學(xué)試劑、生長(zhǎng)因子的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)模式；2)使用成熟體細(xì)胞促進(jìn)干細(xì)胞分化的共培養(yǎng)誘導(dǎo)模式。雖然一些化學(xué)試劑和外源生長(zhǎng)因子等有促進(jìn)干細(xì)胞定向分化的作用，但是單靠有限種類的細(xì)胞因子組合難以維持細(xì)胞正常的生理功能，并且化學(xué)試劑的毒性可能刺激干細(xì)胞發(fā)生變異，因此使用條件培養(yǎng)液不僅誘導(dǎo)效果有限，還會(huì)增加臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。共培養(yǎng)誘導(dǎo)模式是使用誘導(dǎo)細(xì)胞來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞定向分化，可進(jìn)一步模擬體內(nèi)多種細(xì)胞共存的生長(zhǎng)微環(huán)境，獲得的分化細(xì)胞具有較高的生理功能。共培養(yǎng)模式可分為直接接觸與非接觸共培養(yǎng)方式。直接接觸共培養(yǎng)方式是將體細(xì)胞和干細(xì)胞共同培養(yǎng)在同一個(gè)體系中，兩者直接接觸，這種方式存在著干細(xì)胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等嚴(yán)重問(wèn)題，不能應(yīng)用于臨床。非接觸共培養(yǎng)方式，如常用的Transwell體系，依靠聚碳酸酯膜等分離膜將兩種細(xì)胞分隔開(kāi)，在同一體系中實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，解決了不同細(xì)胞的分離問(wèn)題。然而，Transwell體系中細(xì)胞以二維方式生長(zhǎng)，與體內(nèi)細(xì)胞真實(shí)生長(zhǎng)狀況差別較大，大量研究表明體外二維培養(yǎng)體系使得細(xì)胞丟失其在體內(nèi)具有的正常生物學(xué)性狀，而體外三維培養(yǎng)則較好地維持了細(xì)胞功能。另外，Transwell體系基于為24孔板或6孔板，體系規(guī)模很小，價(jià)格昂貴，半透膜的作用面積有限，內(nèi)部缺乏流體流動(dòng)，存在嚴(yán)重的物質(zhì)濃度梯度，這使得現(xiàn)有的Transwell體系在規(guī)模、效率以及成本等方面均不能滿足未來(lái)臨床應(yīng)用的大量需求。因此，急需研發(fā)一種便捷實(shí)用的、低成本的、可規(guī)模化操作的非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)干細(xì)胞體外三維定向分化的生物反應(yīng)器，以實(shí)現(xiàn)調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)干細(xì)胞體外三維定向分化的生物反應(yīng)器，其既能促進(jìn)干細(xì)胞在三維條件下向誘導(dǎo)細(xì)胞類型體外定向分化，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)細(xì)胞的去除以及分化細(xì)胞的收獲。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

所述生物反應(yīng)器為一用于細(xì)胞培養(yǎng)的容器，于容器中設(shè)有一個(gè)或二個(gè)以上的分隔網(wǎng)，將容器分隔成二個(gè)以上的腔室；包埋有誘導(dǎo)細(xì)胞的海藻酸鈉微膠囊和包埋有干細(xì)胞的海藻酸鈣微膠珠分別置于不同的腔室中，從而在同一體系中實(shí)現(xiàn)了兩種或兩種以上細(xì)胞在三維生長(zhǎng)條件下的非接觸動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)；該反應(yīng)器通過(guò)微膠囊內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)因子促進(jìn)干細(xì)胞在三維條件下的定向分化；在分化結(jié)束后，可獲得含有分化細(xì)胞的微膠珠，利用檸檬酸鈉溶液溶解該微膠珠，最后可獲得分化細(xì)胞。

所述分隔網(wǎng)的材質(zhì)包括金屬或非金屬；

金屬包括碳素鋼、或包含鐵、鋅、錳、銅、鎳、銀元素中一種或二種以上的合金鋼；

非金屬包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚酯樹(shù)脂、或聚甲基丙烯酸甲酯；

分隔網(wǎng)的目數(shù)范圍從10到100。

所述干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、或間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞包括體細(xì)胞或細(xì)胞系；

干細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞可以是同源同種細(xì)胞、同源異種細(xì)胞、異源異種細(xì)胞；

調(diào)控干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘細(xì)胞、或神經(jīng)組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系；

調(diào)控干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括；原代心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞系；

調(diào)控干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、原代內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞系、肝星狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、3T3細(xì)胞系、或肝組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系；

調(diào)控干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括原代胰島或β-胰島細(xì)胞；

調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括原代成骨細(xì)胞或骨組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系；

調(diào)控干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)細(xì)胞包括原代軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞系；