[發明專利]一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法

無效

• 申請號: 201210519984.5
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103063791A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 侯宏衛;胡清源;熊巍;張小濤;劉彤;陳歡;朱風鵬;李中皓;龐永強;邊照陽;劉楠;張洪非;唐綱嶺
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）酶解尿液樣本：

取尿液樣本，置于室溫下解凍，調節尿液pH，依次加入醋酸緩沖液、β-葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，水浴振蕩酶解過夜；

（2）固相萃取純化：

選取C18固相萃取柱，上樣前經甲醇和水活化，將酶解后的尿液樣本全部上樣，用水和甲醇/水淋洗，吹干后，用甲醇洗提，過濾后即為樣品待測液；

（3）混合空白尿液和標準工作液的配制：取三個非吸煙者的尿液混合均勻作空白尿液，配制不同濃度的1-OHP,3-OHB[a]P和3-OHB[a]A標準工作溶液；

（4）液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）測定：

分別吸取空白尿液和配制好的不同濃度的1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，按內標法以峰面積計算出樣品待測液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量。

2.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（1）中酶解過程依次加入的醋酸緩沖液（0.5mol/L，pH5.0）和β-葡糖甘酸酶（30U/mL）/芳基硫酸酯酶（60U/mL），其體積分別為2.5mL和30μL。

3..根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（1）中用0.2mol/L的HCl調節尿液的pH到5.0。

4.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（4）中固相萃取柱選取2.0×100mm,2.5μmPhenomenex?Synergi?Hydro-RP色譜柱。

5.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（4）中選取40%超純水和60%乙腈初始流動相體系，分析時間為10min，進樣量為10μL。

6.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（4）中梯度洗脫條件為0min-2.5min，40%超純水+60%乙腈；3.5min-8.0min，10%超純水+90%乙腈；8.1min-11.0min，90%超純水+10%乙腈；11.1min-12.0min，40%超純水+60%乙腈，流動相流速為380μm/min。

7.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（4）串聯質譜檢測器的條件：APCI⁺，噴霧針電壓5500V；離子源溫度400°C；霧化氣為氮氣，霧化氣流速設為60psi，氣簾氣為氮氣，流速為25psi，碰撞氣8psi。

8.根據權利要求1所述的一種同時測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步驟（4）中測定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的具體操作為：吸取標準空白尿液和配制好的不同濃度的1-OHP,3-OHB[a]P和3-OHB[a]A標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統，繪制1-OHP，3-OHB[a]P和3-OHB[a]A的線性回歸方程，對酶解和固相萃取凈化之后的樣品待測液進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。