[發(fā)明專利]一種脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)的測定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210519701.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN102944569A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程櫟;王偉;肖萱;劉玉靜;張偉強(qiáng);楊青松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京泰德制藥股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N23/22
• 分類號(hào): G01N23/22;G01N1/28
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)的測定方法，具體涉及一種采用負(fù)離子發(fā)生裝置處理待測樣品及其掃描電鏡中的載樣金屬網(wǎng)，來測定具有軟質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)的脂微球/脂質(zhì)乳劑的微觀形態(tài)的方法。

背景技術(shù)

掃描電子顯微鏡是1965年發(fā)明的較現(xiàn)代的細(xì)胞生物學(xué)研究工具，主要是利用二次電子信號(hào)成像來觀察樣品的表面形態(tài)，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。二次電子能夠產(chǎn)生樣品表面放大的形貌像，這個(gè)像是在樣品被掃描時(shí)按時(shí)序建立起來的，即使用逐點(diǎn)成像的方法獲得放大像。掃描電鏡是一種用途廣泛的多功能儀器，具有很多優(yōu)越的性能，它可以進(jìn)行三維形貌的觀摩和分析，在觀察形貌的同時(shí)進(jìn)行微區(qū)的成分分析。其應(yīng)用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：材料形貌觀察分析和成分分析。掃描電子顯微鏡由三大部分組成：真空系統(tǒng)，電子束系統(tǒng)以及成像系統(tǒng)。掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行，無論是水或脫水溶液，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥。

脂微球/脂質(zhì)乳劑是將藥物溶于脂肪油中經(jīng)磷脂乳化分散于水相后制成的脂質(zhì)乳劑，是一種以脂肪油為軟基質(zhì)并被磷脂膜包封的微粒體分散系，其平均粒徑200nm，稱為脂微球。脂微球/脂質(zhì)乳劑作為藥物載體，靶向聚集于病變部位實(shí)現(xiàn)了藥物的“靶向治療”。通過掃描電鏡（TEM），可以觀察脂微球/脂質(zhì)乳劑的微觀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡主要通過高能電子束穿過非常薄的固體樣品表面，通過電子束能量的變化來掃描出樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)。使用TEM進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，為了防止空氣中離子及水對(duì)于電子束的干擾，因此需要在真空室中進(jìn)行掃描，這樣就必需使用完全干燥的固體樣品，而脂微球/脂質(zhì)乳劑中微粒的形態(tài)比較不穩(wěn)定，干燥后如果濃度過大，則會(huì)發(fā)生脂微球變形或聚合的作用，這樣就無法觀測到脂微球的真實(shí)結(jié)構(gòu)。而如果使用濃度較低的脂微球/脂質(zhì)乳劑溶液樣品，因?yàn)橹⑶蚴怯闪字椭瑯?gòu)成的，因此表面為磷脂的親水基團(tuán)，主要為膽堿（-N（CH₄）₃）或氨基（-NH₂），這些基團(tuán)在水溶液中溶解后帶有正電荷，會(huì)吸附電子束的高能電子，因此在電鏡圖譜中為黑色球體，白色背景，這與大家對(duì)于電鏡圖譜的普遍認(rèn)知不同。為了解決這個(gè)問題，需要使用染色劑對(duì)樣品進(jìn)行染色。染色劑主要是帶有正電荷的基團(tuán)，在水溶液中電離后與微球表面的磷脂負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合，使干燥后的樣品帶有正電荷，這樣就會(huì)出現(xiàn)黑色的背景及白色的球體。但是由于TEM試驗(yàn)使用的聚合物或者金屬制細(xì)網(wǎng)作為樣品載體，聚合物或者金屬均帶有正電荷，對(duì)于樣品微粒帶有一定的電排斥而樣品溶液本身的濃度又比較稀，因此試驗(yàn)的成功率非常低，重現(xiàn)性很差，經(jīng)常多個(gè)樣品中均無法觀察到任何脂微球。

本發(fā)明人通過潛心研究發(fā)現(xiàn)，通過采用在天平稱量中使用避免造成天平稱量漂移現(xiàn)象的負(fù)離子發(fā)生裝置可以解決目前現(xiàn)有技術(shù)中采用掃描電鏡測定脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)中存在的缺陷，采用電解空氣產(chǎn)生臭氧離子的原理產(chǎn)生負(fù)離子氣流，從而中和樣品或容器中的正電荷。同時(shí)采用負(fù)離子發(fā)生裝置對(duì)樣品金屬制或聚酯制的載樣容器進(jìn)行處理后再利用掃描電鏡進(jìn)行觀察，可以穩(wěn)定的獲得清晰的脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)的TEM譜圖。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種通過對(duì)檢測樣品和載樣容器用負(fù)離子發(fā)生裝置處理后，采用掃描電鏡測定具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)的脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)的方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)中存在的成功率低、重現(xiàn)性差、對(duì)樣品破壞嚴(yán)重、樣品用量大、不能真實(shí)反映樣品微觀結(jié)構(gòu)的缺陷。

本發(fā)明提供的脂微球/脂質(zhì)乳劑微觀結(jié)構(gòu)的測定方法包括將待測樣品用稀釋液稀釋成一定的濃度，干燥后用染色劑染色，采用負(fù)離子發(fā)生裝置處理染色后的樣品和掃描電鏡的載樣容器后通過掃描電鏡測定。

其中，待測樣品的稀釋液為水。

其中，樣品的稀釋濃度為500?~5000倍。

其中，染色劑為磷鉬酸或磷鎢酸或醋酸鈾。

其中，負(fù)離子發(fā)生裝置為日本島津公司Stablo除電器或德國梅特勒公司ANTIST-KIT-UN去靜電裝置或德國賽多利斯公司YSTP01去靜電筆。

其中，樣品的干燥方式為真空減壓干燥或紅外燈干燥或自然風(fēng)干。

附圖說明

圖1為比較例1的電鏡照片。

圖2為比較例2的電鏡照片。

圖3為比較例3的電鏡照片。

圖4為比較例4的電鏡照片。

圖5為實(shí)施例1的電競照片。

圖6為實(shí)施例2的電鏡照片。