[發明專利]用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因及檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210519682.8
• 申請日: 2012-12-06
• 公開（公告）號: CN103014024A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 劉麗云;金東;王藝婷;徐建國;葉長蕓
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因以及檢測該基因的引物和探針，本發明還涉及利用該引物和探針進行弗氏枸櫞酸桿菌檢測的試劑盒。

背景技術

弗氏枸櫞酸桿菌（Citrobacter?freundii）屬于枸櫞酸桿菌屬，腸桿菌科。革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，周身鞭毛，菌毛，無芽胞，無莢膜。弗氏枸櫞酸桿菌廣泛存在自然界，是人類和動物腸道的寄生菌。已有文獻報道它可引起原發和繼發的感染。弗氏枸櫞酸桿菌可以在正常人和動物的糞便以及環境中分離到。然而，研究者逐漸認識到弗氏枸櫞酸桿菌可以引起腹瀉和其他感染如：尿道感染、腦膜炎、膿毒癥以及醫院獲得性感染。

與其他腸道病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌等相比，弗氏枸櫞酸桿菌很少被報道引起腹瀉等腸胃炎。這可能與臨床樣本篩查中，很少將弗氏枸櫞酸桿菌作為常規篩查的菌株。但是，弗氏枸櫞酸桿菌也能引起一些偶發和爆發的病例。弗氏枸櫞酸桿菌也引起類似大腸桿菌引起的重癥腸胃炎。Tschape等報道弗氏枸櫞酸桿菌在德國的一家托兒所和幼兒園引起的暴發，造成腸胃炎152例，其中8例發展為HUS。Ibenyassine等對食品進行調查發現食品中發現弗氏枸櫞酸桿菌的檢出率可達18.7%，我國的多個研究中也表明食品中弗氏枸櫞酸桿菌也有較高的分離率。在我國，一些食物中毒或腹瀉病人的糞便標本中，不能分離到常見的致病菌，卻能分離到弗氏枸櫞酸桿菌。弗氏枸櫞酸桿菌也可能是院內感染最重要的致病菌之一，2002年在日本名古屋的一所醫院外科發生了耐三代頭孢的弗氏枸櫞酸桿菌感染的小型暴發。研究提示弗氏枸櫞酸桿菌可能是一種尚未被人們充分認識的腸道病原菌。

在感染性腹瀉病原菌檢測過程中，往往忽略對弗氏枸櫞酸桿菌的檢測，且目前沒有特異的弗氏枸櫞酸桿菌的篩選培養基。弗氏枸櫞酸桿菌很難和其他腸道菌區別，目前只能通過生化鑒定來進行分開。然而生物鑒定費時費力，不利于臨床對病原菌快速檢測的要求。

近年來，實時熒光TaqMan?PCR技術（real?time?TaqMan?PCR,TaqMan是羅氏公司的注冊商標）廣泛應用于多種病原微生物的檢測，與普通PCR方法相比較，實時熒光TaqMan?PCR技術在普通PCR的基礎上加入一條特異的熒光探針，并且該技術對引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實時熒光TaqMan?PCR中的探針序列必須與目標序列完全匹配，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，但在PCR擴增時，隨著引物的延伸Tag酶的5’到3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可接受到熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。因此實時熒光定量PCR方法比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan?PCR技術的應用中，探針的選擇是一個重要因素，因為其涉及到與引物的匹配，以及最關鍵的檢測特異性的問題。

目前，在國內外研究中，沒有對弗氏枸櫞酸桿菌進行熒光定量PCR檢測方法的報道。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因。

本發明的第二個目的在于提供針對上述靶基因的特異性引物和探針；

本發明的第三個目的在于提供檢測弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒。

基于以上目的，本發明對弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因與NCBI上公布的其他細菌的核苷酸序列進行反復比對和篩選，發現弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因僅與沙門氏菌同源性較高，同源性達到84%，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。而且該基因在100bp-650bp之間特異性很高，具有高度的保守性，可以很好的區分弗氏枸櫞酸桿菌與其相近的沙門氏菌和枸櫞酸桿菌屬的其他種。

本發明針對弗氏枸櫞酸桿菌的一個三羧酸循環調控基因(簡稱TTRP)特有序列設計引物和TaqMan探針，并將獲得的特異性引物和探針在NCBI數據庫進行比對，以排除引物-探針與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優化后的引物、探針序列。

進一步，本發明提供用于特異性擴增上述靶基因序列或其特異片段的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。其中探針的5’標記熒光基團FAM，3’標記淬滅基團BHQ1。上游引物選自于TTRP基因的第211到229位核苷酸。下游引物選自TTRP基因的第104到126位核苷酸。

本發明提供的優選的引物序列為：

上游引物：GCAGGACAGGAAGCGTCTG，