[發明專利]一種非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑及制備方法

在審

• 申請號: 201210516466.8
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN103845739A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 趙志敬;胡廣;王學忠
• 申請（專利權）人: 紹興科銳捷生物科技有限公司;北大工學院紹興技術研究院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K9/19;A61K47/26
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技術領域

本發明屬于診斷試劑技術領域，具體涉及一種穩定的非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑。?

背景技術

非對稱二甲基精氨酸(Asymmetric?dimethylarginine，ADMA)是一種心血管疾病的生物標記物。該化合物在胞內生成后會轉移至血漿內，可抑制精氨酸產生一氧化氮，而一氧化氮是對內皮細胞及心血管有益的物質。研究表明，ADMA作為危重病的危險因子，其體內的表達水平對急性心肌梗塞，動脈粥狀硬化、糖尿病以及肝腎功能衰竭等疾病的發生、發展和轉歸具有重要的預測價值和臨床意義。因此，快速準確檢測ADMA含量方法的建立對基礎研究和臨床診斷都有非常重要的意義。?

目前，ADMA最主要的檢測方法包括質譜法，高效液相色譜法和酶聯免疫法，但這些檢測方法存在測定程序復雜、耗時、樣品需要預處理以及測試儀器價格昂貴等弊端，不能應用于臨床大流量的自動化分析。而酶學循環法的ADMA檢測試劑盒原理如下：非對稱二甲基精氨酸水解酶(Dimethylarginine?Dimethylaminohydrolase，DDAH)催化組織樣本中的ADMA水解，生成L-瓜氨酸(L-citrulline)；L-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinehydrolase)和鳥氨酸氨甲酰轉移酶(Ornithline?carbamoyl?transferase，OCT)及其底物組成的酶循環反應系統中不斷循環反應，從而大大地提高反應靈敏度，L-瓜氨酸生成量與樣本中的ADMA含量成正比，通過測循環酶反應體系中氨的生成速率，就可以達到測定樣本中ADMA的目的。該方法可直接應用于目前醫院檢驗科廣泛使用的臨床生化自動分析儀，無需額外的特別處理、操作簡便、靈敏度高且成本低廉，可實現快速、大流量的樣本測試，使ADMA成為臨床常規檢測項目成為可能，具有極高的科學和經濟價值。?

DDAH是酶學循環法檢測早期急性心肌梗塞(Acute?myocardialinfarction，AMI)的生物標記物——的重要工具酶。而DDAH在生物學上的功能有調節NO生成，促進血管新生和細胞分化等，目前的研究主要集中于它在疾病代謝中所起的調節作用。而DDAH的表達純化則多用于功能研究和藥物篩選模型的實驗材料，所以DDAH的生產仍局限于機制研究的實驗室水平。所生產的DDAH穩定性差，只能進行低溫保存，在常溫下保存會發生降解，?不能滿足產業化的試劑盒用酶對于常溫保存等方面的需求。?

發明內容

由于DDAH本身穩定性不好，可以將其制備成凍干粉針劑提高其穩定性，而DDAH在普通的凍干過程中易損失大量活性。針對現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種穩定性顯著提高的非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑。采用本發明的組成制備的非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑進行一步改善了制劑的穩定性，能顯著延長試劑的使用期限。?

本發明研究人員在對非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑的研究過程中發現，采用本發明的處方制備的凍干粉針劑在冷凍干燥和長期保存過程中的穩定性明顯的提高，對于該試劑的臨床使用具有重要意義。?

本發明非對稱二甲基精氨酸水解酶凍干粉針劑由下列組分制成：非對稱二甲基精氨酸水解酶，三羥甲基氨基甲烷，二硫蘇糖醇，甘露醇，葡萄糖，鹽酸，超純水。?

其優選組分為：?

上述組成中的鹽酸為1M鹽酸。?

其凍干粉針劑的制備工藝為：?

1)按處方稱取原輔料投料量，先加80％水，加三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇、甘露醇、葡萄糖、非對稱二甲基精氨酸水解酶，攪拌溶解后，加用1M鹽酸調整pH至6.2后攪拌15分鐘；?

2)測定pH合格后，將所配置的試劑在筒式過濾器中用0.22微米微孔濾膜過濾除菌，分裝；?

3)將分裝后的非對稱二甲基精氨酸水解酶液放于冰干箱，預凍至-40度，保溫4小時后抽真空加熱升華。用720分鐘使溫度升高至0度，保溫60分鐘，用120分鐘使溫度升高至15度，保溫60分鐘，用120分鐘使溫度升高至18度，并保溫180分鐘，制品溫度與設置溫度一致時，經測定壓力合格后，凍干結束；?

4)出箱，軋蓋，檢驗，包裝即得。?

研究發現未加入葡萄糖的凍干制劑，改變凍干保護劑或賦形劑的種類對其穩定性改進作用效果甚微，本發明研究人員在實驗中嘗試在凍干粉針劑中使用的各用常用凍干保護劑或賦形劑，而綜合凍干后的性狀、凍干過程pH?的變化優選凍干保護劑為葡萄糖，賦形劑為甘露醇。?

制備實施例?