[發明專利]一種用于制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體的多肽及其應用

有效

• 申請號: 201210516218.3
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103087154A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 戈應濱;滕文臣;曹曉健;董虎
• 申請（專利權）人: 江蘇澳格姆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C07K16/40;G01N33/577
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 繆友菊

技術領域

本發明屬于生物化學領域，特別涉及一種用于制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體的多肽，還涉及該多肽在制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體中的應用。

背景技術

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)是生物神經傳導中的一種關鍵酶，是主要的信號傳遞分子，主要存在于多細胞動物的神經元間、神經元與肌肉細胞間的化學突觸上，為膜結合蛋白，定位于細胞膜和突觸前后膜，能快速水解神經遞質乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)從而終止ACh對膽堿能受體的興奮作用，保持神經沖動傳導的靈敏性。乙酰膽堿酯酶是生物體內反應最快的酶之一，降解一個分子約80微秒。

由于在周圍神經中，運動神經束和感覺神經束乙酰膽堿酯酶的含量相差數十倍，定量分析手術斷端神經束的乙酰膽堿酯酶含量能夠在臨床上快速、準確地分辨感覺神經和運動神經，在臨床上有巨大的應用潛力。

現有乙酰膽堿酯酶的含量通常采用技術成熟穩定的壓電免疫傳感器測定，該方法快速、準確，具有在線分析的功能。壓電免疫傳感器的檢測區間主要取決于檢測乙酰膽堿酯酶的芯片，而該芯片的檢測區間主要取決于其中所用的單克隆抗體的親和性和效價。現有市售的抗體制備的抗體芯片，其檢測濃度值的線性區間在0.5-2μg/ml，和夾心ELISA檢測區間相似。然而，由于手術切除標本斷面較小，溶解于細胞裂解液中的蛋白含量較低，其中含有的乙酰膽堿酯酶在夾心ELISA檢測的線性范圍之外（小于1ng/ml）。因此，將免疫壓電傳感器檢測乙酰膽堿酯酶的含量的方法應用于臨床，迫切需要制備更高親和性和高效價的單克隆抗體。

現有用于壓電免疫傳感器的單克隆抗體，主要選取乙酰膽堿酯酶抗原蛋白質內免疫原性較高的多肽，藕聯大分子（如BSA、BTG）為抗原，免疫后用多肽氨基酸序列相同而藕聯的大分子不同的抗原篩選出單克隆抗體；然而，免疫原性較高的多肽往往處于抗原蛋白質的疏水端，導致現有乙酰膽堿酯酶抗體的親和性和效價較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種親和性高、效價高的多肽即其制備方法。

在本發明的第一方面，提供一種用于制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體的多肽，包含SEQ?ID?No：1或2所示的氨基酸序列，所述SEQ?ID?No：1的氨基酸序列為NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH，所述SEQ?ID?No：2的氨基酸序列為NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH。該多肽可特異性的與乙酰膽堿酯酶抗體結合。

在本發明的第二方面，提供了一種多肽偶聯物，所述多肽偶聯物由多肽、交聯劑和大分子物質構成，其中所述多肽包含SEQ?ID?No：1或2所示的氨基酸序列，所述交聯劑為甲醛和乙酸鈉的混合物，所述大分子為牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔蟲戚血藍蛋白（LKH）或甲狀腺球蛋白（BTG）。

在本發明的第三方面，提供了一種用于制備檢測乙酰膽堿酯酶的抗體，所述抗體特異性地與權利要求1所述的多肽結合。

作為優選，本發明的第三方面所述抗體為單克隆抗體。

在本發明的第四方面，提供了上述多肽在制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體中的應用。

所述應用，包括以下步驟：

（1）將包含SEQ?ID?No：1或2所示的氨基酸序列的多肽偶聯大分子獲得全抗原；

（2）將所述全抗原通過免疫制得用于檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體；

（3）將所述單克隆抗體應用于壓電免疫傳感器檢測乙酰膽堿酯酶。

有益效果：本發明提供的用于制備檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體的多肽親和性高、效價高，利用該多肽制備得到的單克隆抗體應用于壓電免疫傳感器，對乙酰膽堿酯酶的檢測靈敏度高、準確率高。

本發明通過對乙酰膽堿酯酶的蛋白質結構中每個氨基酸的親水性、抗原性分析，找尋和設計了2個親水性和抗原性較高氨基酸序列；再將這兩個親水性和抗原性較高的氨基酸序列偶聯大分子獲得全抗原，通過免疫制得用于檢測乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體，制得的單克隆抗體親和性高、效價高。并將該單克隆抗體應用于檢測乙酰膽堿酯酶的壓電免疫傳感器，可顯著提高檢測靈敏度與準確率。

附圖說明

圖1為實施例3制得的鼠單抗在人白血病細胞中AChE的免疫共沉淀圖。

圖2為實施例3制得的鼠單抗在鼠腦組織中AChE的免疫共沉淀圖。

圖3為鼠腦組織AChE單抗免疫組化圖。

圖4為人脊髓前根AChE單抗免疫組化圖。