[發明專利]介導膜穩定CD40L基因的衣殼蛋白突變的雙鏈重組腺相關病毒制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210516116.1
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103060331A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 吳劍卿;趙衛紅;許偉
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/864;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種人源膜穩定突變基因CD40L-M，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1。

2.根據權利要求1所述的人源膜穩定的突變基因CD40L-M，其特征在于：

CD40L-M基因所編碼的氨基酸序列與GenBank報道的人CD40L的氨基酸序列相比具有如下突變：第114位氨基酸由Gln變成Pro，第115位氨基酸由Lys變成Arg，第117位氨基酸由Asp變成Glu，第118位氨基酸由Gln變成Glu，第119位氨基酸由Asn變成Asp。

3.一種質粒載體pdsAAV-CB-CD40L-M，其特征在于：它包含CD40L-M基因。

4.權利要求3所述的質粒載體pdsAAV-CB-CD40L-M的構建方法，其特征在于：

在源克隆pcDNA3.1⁺-CD40L-WT的目的基因片段中通過特異引物設計、高保真DNA聚合酶PCR擴增、自身連接處理引入點突變，再通過亞克隆，得到pdsAAV-CB-CD40L-M質粒載體。

5.一種重組腺相關病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，其特征在于：它包含CD40L-M基因。

6.根據權利要求5所述的重組腺相關病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，其特征在于：所述重組腺相關病毒的載體是從不同血清型的自身互補的雙鏈腺相關病毒scAAV野生體和突變體中遴選出的，外殼蛋白719位點酪氨酸殘基點突變為苯丙氨酸的自身互補的重組AAV2/5載體。

7.權利要求5或6所述的重組腺相關病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M，已保藏于中國典型物保藏中心，保藏日期2012年11月26，保藏編號：CCTCC?NO：V201252分類命名：介導膜穩定CD40L基因的衣殼蛋白突變的重組雙鏈腺相關病毒。

8.權利要求5所述的重組腺相關病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M的制備方法，其特征在于：采用三質粒共轉染法包裝腺相關病毒，經純化、濃縮后，Slot-blot測定病毒滴度，AAV包裝時，通過選擇不同的野生型或外殼蛋白突變型AAV的pAAV-R/C，及現有的pdsAAV-GFP和pHelper輔助質粒包裝成scAAVX-R/C-GFP病毒顆粒，從不同的血清型scAAV野生型和突變型載體中，通過轉導肺癌細胞GFP基因的表達效率，遴選出轉導肺癌細胞效率最高的載體scAAV2/5-Y719F-GFP，再以三質粒pAAV2/5-Y719F-R/C、pdsAAV-CB-CD40L-M、pHelper共轉染法，構建得到scAAV2/5-Y719F-CD40L-M。

9.權利要求5所述的重組腺相關病毒scAAV2/5-Y719F-CD40L-M在制備治療肺癌藥物中的應用。