[發明專利]適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法

無效

• 申請號: 201210514827.5
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN102925430A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 張道遠;李小雙;李海燕
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆生態與地理研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

技術領域

本發明涉及一種用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法。

背景技術

棉花是我國乃至世界范圍內重要的經濟作物，目前我國是世界上最大的棉花生產國。近年來，隨著分子生物學技術與遺傳育種技術的不斷發展，一大批具有抗生物脅迫（抗蟲）和抗非生物脅迫（抗除草劑、抗旱）的基因成功轉入棉花。這些優質的基因資源為作物豐產和減少環境污染做出了重大的貢獻。然而在培育新品種時，每一代轉基因棉花的大田檢測工作一直是困擾育種家和分子生物學研究者的一大難題。因為該環節工作量大，費時費力。經常需要短時間內從大田種植的幾千株甚至上萬株棉花中鑒定出轉基因陽性株。這就需要一種簡便、高效、快速的鑒定轉基因大田試驗材料的分子生物學方法。而且，根據我國轉基因農作物安全性申報的要求，轉基因棉花安全性申報也需要進行分子生物學檢測。目前對轉基因作物的檢測方法可分為蛋白檢測方法和核酸檢測方法，而核酸檢測方法中的聚合酶鏈式反應（PCR）技術由于其高靈敏度、高特異性、操作簡便已經成為轉基因植物及其產品檢測的主要方法。

進行PCR檢測的前提是快速大量的提取棉花的基因組DNA。目前，對于小麥、玉米、水稻、大豆和油菜等均已建立起高效快速提取基因組DNA的技術。但對于棉花來說，由于棉花富含棉酚、多糖、單寧等次生代謝產物，該類物質在細胞破碎時極易氧化，并能與核酸和蛋白結合形成復合物，影響高質量棉花DNA的提取，進而影響后續PCR、酶切等一系列分子生物學操作。比如傳統的CTAB法利用高鹽溶液沉淀蛋白和酸性多糖，低鹽溶液沉淀核酸的原理去除蛋白和糖類物質，但這樣便增加了加入不同濃度NaCl并抽提、離心將其去除的操作，同時為了提高得率往往需要長時間的沉淀、冰浴等步驟。而SDS法以及基于該法改進的各種方法則利用SDS充分裂解細胞釋放核酸物質，并用氯仿：異戊醇反復抽提的方法來純化DNA，但是該法對棉花這種富含次級代謝產物的物種來說提取效率很低。很多改進的SDS法加入抗氧化物質來抑制酚類物質的氧化以提高產率，但效果并不理想。有學者提出CTAB-SDS結合的改良方法提取棉花基因組DNA，雖然得到了大量的高質量的基因組DNA，但仍步驟復雜、耗時較長，不適于轉基因棉花的快速PCR檢測。另外，以往的取材方法多為取功能葉后包入紙袋或塑料袋中帶回實驗室，然后直接放入冰箱冷凍直至使用。這樣的取材方法增加了材料在離體、運輸、實驗前裝管編號等環節的操作時間以及樣品反復凍融的次數，導致DNA降解，進一步增加了棉花高質量基因組DNA提取的難度。

PCR技術可以實現在體外對目標DNA進行上百萬次的擴增，因此是目前最準確的檢測轉基因作物及其產品的方法之一。該技術對模板DNA的純度要求并不是十分嚴格，而且需要的量也并不是很多。因此，能夠找到一種快速提取并能滿足PCR擴增需求的棉花基因組DNA的方法是解決轉基因棉花育種中陽性株檢測工作量大問題的關鍵。

發明內容

本發明目的在于，提供一種適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，該方法將棉花植株頂部的幼嫩葉片裝入離心管中，加入提取液和鋼珠，對樣品進行破碎處理，然后水浴，加抽提液抽提，用異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗一遍，沉淀溶于水即為提取的DNA。本發明解決了棉花基因組DNA提取步驟復雜、耗時耗力的問題，提供了一種能夠快速、批量的提取滿足PCR檢測需求的DNA的方法，采用該方法能夠從棉花葉片中高效、快速、簡便的提取滿足PCR檢測的模板DNA，能夠應用于轉基因棉花育種和安全性申報等環節中的分子生物學檢測。

本發明所述的適用于PCR的棉花基因組DNA快速、批量制備方法，按下列步驟進行：

a、取健康的棉花葉片0.05-0.15g放入2mL離心管內，加入600μL的提取液為NaCl、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮、β-巰基乙醇和RNase?A的混合物，并加入兩粒鋼珠；

b、將步驟a裝有樣品的離心管放入細胞破碎儀內，于30HZ的頻率破碎5min處理，將處理后的離心管放入溫度65℃水浴鍋中水浴10min；

c、取出離心管，在室溫下加入700μL氯仿:異戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm離心6min，

d、吸上清于新的離心管中，加等體積的異丙醇混勻，室溫放置10min，12000rpm離心6min，棄上清，得到DNA粗提沉淀；

e、將所得DNA粗提沉淀用1mL體積濃度為75%的乙醇洗滌，12000rpm離心3min，棄上清液，得到DNA沉淀，再加60μL滅菌雙蒸水，溫度-20℃保存即可。