[發(fā)明專利]一種宮膜干細胞庫的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210514551.0
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103849944A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉召青;陳彥田;齊瀚實
• 申請（專利權(quán)）人: 上海坤愛生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N5/074;C12N5/0789
• 代理公司: 上海集信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31254
• 代理人: 周成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及干細胞庫的構(gòu)建，更具體涉及宮膜干細胞庫的構(gòu)建。

背景技術(shù)

1999年，《Science》將人類胚胎干細胞研究成果評為當(dāng)年世界十大科技進展之首，2000年，《Time》周刊將其列為20世紀末世界十大科技成就之首，并認為胚胎干細胞和人類基因組將同時成為新世紀最具發(fā)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。至此干細胞研究成為近年來生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點之一。干細胞(stem?cells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。干細胞(Stem?Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，改變了人類疾病的應(yīng)對方法，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細胞”。目前干細胞來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞，但這兩種來源都存在著部分局限性，因此尋找一種克服腫瘤形成的潛在性、標(biāo)本來源的缺乏及倫理學(xué)爭議等弊端的干細胞來源具有重要意義。近年來，美國Musina領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從健康女性的月經(jīng)血中得到分離的干細胞。宮膜干細胞（MenSCs）避免了其他干細胞的不足，成為一種全新的具有重大研究和應(yīng)用潛力的干細胞。

然而，經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，報道的宮膜干細胞的獲取方法中，并沒有人針對分離過程中除菌的方法以及除菌的效果進行報道，不能保證宮膜干細胞分離的成功率，不利于后續(xù)過程的進行。

本發(fā)明者通過摸索，根據(jù)細胞與細菌、真菌等的密度差異，通過密度梯度離心以及一定范圍內(nèi)反復(fù)洗滌離心的方法，可以去除細菌、真菌等，進而降低宮膜干細胞染菌的可能性，提高分離的成功率。通過大規(guī)模擴增培養(yǎng)可以獲得大量的宮膜干細胞，并長期保存，定期質(zhì)量檢測，以便為未來的臨床以及科研應(yīng)用研究提供大量的宮膜干細胞資源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服宮膜干細胞分離過程中的不足，實現(xiàn)高效的宮膜干細胞分離和長期保存。

本發(fā)明提供一種宮膜干細胞庫的構(gòu)建方法，包括月經(jīng)血采集、宮膜干細胞分離除菌、擴增及分析檢測、長期保存及定期檢測的步驟，該方法的特征在于：所述宮膜干細胞分離除菌包括用密度梯度離心或磁珠分選得到單個核細胞，并在密度梯度離心前后多次用緩沖液沖洗去除殘余細菌和雜質(zhì)，所述密度梯度離心法使用密度為1.077的細胞分離液，300-500×g，15℃-25℃離心20-40分鐘，所述緩沖液沖洗中使用的緩沖液為含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的PBS。

本發(fā)明的宮膜干細胞庫的構(gòu)建方法中，月經(jīng)血的采集包括使用月事杯收集月經(jīng)血，并保存在月經(jīng)血保存液中，所述月經(jīng)血保存液為添加肝素鈉的PBS鹽緩沖溶液或SPB鹽緩沖溶液。

本發(fā)明方法中，月經(jīng)血保存液中還可添加抗菌物質(zhì)，所述抗菌物質(zhì)選自兩性霉素、青霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢羥氨芐、頭孢呋辛、頭孢噻吩、鏈霉素、妥布霉素、四環(huán)素、土霉素、琥乙紅霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、紅霉素、克林霉素和林可霉素。月經(jīng)血保存液中添加的抗菌物質(zhì)優(yōu)選兩性霉素、青霉素、鏈霉素。

本發(fā)明方法中的擴增步驟包括將分離所得單個核細胞于α-MEM+10％-20％血清完全細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48-72小時后，更換新鮮的培養(yǎng)液，以后每3天全換液一次，細胞長滿約80％-90％時，用含EDTA的0.25％胰酶消化，然后進行傳代培養(yǎng)。

本發(fā)明方法中的分析檢測步驟包括無菌性檢測、流式細胞儀檢測、核型檢測和分化能力檢測。

本發(fā)明方法中的長期保存步驟包括將細胞以1×10⁶至1×10⁷細胞/ml的密度重懸在含細胞培養(yǎng)液、DMSO和血清的細胞凍存液中，采用程序降溫盒在-80℃冰箱中過夜進行程序降溫法保存，然后轉(zhuǎn)移到-196℃液氮中長期保存。

在長期保存過程中，進行定期檢測，包括細胞復(fù)蘇后進行細胞活性檢測、無菌性檢測、流式細胞儀檢測和分化能力檢測。

細胞活性檢測每隔12個月進行一次，將細胞復(fù)蘇后用臺盼藍染色檢測細胞存活率。

流式細胞儀檢測包括細胞表面抗原CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、HLA的檢測。

分化能力檢測包括成骨分化能力、成脂分化能力和成軟骨分化能力的檢測。

本發(fā)明的宮膜干細胞庫的構(gòu)建方法中，擴增后的分析檢測和長期保存過程中的定期檢測都要進行無菌性檢測，包括真菌的檢測和細菌的檢測。

本發(fā)明的一個具體實施方式包括以下步驟：

1、月經(jīng)血的收集