[發(fā)明專利]一段單純皰疹病毒DNA序列及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210513622.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103074337A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬明星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明寰基生物芯片產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左

技術(shù)領(lǐng)域：

發(fā)明涉及一段單純皰疹病毒HSV的DNA序列及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)：

單純皰疹病毒（Herpes?simplexvirus,HSv）呈球形，完整病毒由核心、衣殼、被膜(Tegument)及囊膜組成核心含雙股DNA，纏繞成纖絲卷軸。衣殼呈二十面體對(duì)稱，由162殼微粒組成，直徑100nm。衣殼外一層被膜覆蓋，厚薄不勻，最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜，上有突起。有囊膜的病毒直徑為150～200nm。囊膜表面含gb、gC、gD、gE、gG、gH糖蛋白，與病毒對(duì)細(xì)胞吸附/穿入（gB?gC?gD?ge）、控制病毒從細(xì)胞核膜出芽釋放（gH）及誘導(dǎo)細(xì)胞融合（gbgC?gD?gH）有關(guān)。并有誘生中和抗體(gd最強(qiáng))和細(xì)胞毒作用（已知的HSV糖蛋白均可）。?

HSV基因組為一線性DNA分子，由共價(jià)連接的長(zhǎng)片段（L）和短片段（S）組成。每片段均含有單一序列和反轉(zhuǎn)重復(fù)序列。基因組中有72個(gè)基因，共編碼70各異的蛋白質(zhì)，其中除24種蛋白的特性還不清楚外，有18種編碼蛋白組成病毒DNA結(jié)合蛋白及各種酶類，參予病毒DNA合成，包裝及核苷酸的代謝等。30多種不同蛋白組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白（如衣殼蛋白、囊膜蛋白），在保護(hù)HSV的DNA，以及HSV的致病作用和誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用。?

HSV可在多種細(xì)胞中生長(zhǎng)，常用的細(xì)胞系有BHK細(xì)胞，Vero細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞等。病毒初次分離時(shí)，原代乳兔腎細(xì)胞、人胚肺細(xì)胞較敏感。HSV感染動(dòng)物范圍廣泛，多種動(dòng)物腦內(nèi)接種可引起皰疹性腦炎，小白鼠是足墊接種可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)致死性感染，家兔角膜接種引起皰疹性角膜炎，豚鼠陰道內(nèi)接種可引起宮頸炎和宮頸癌。接種雞胚絨毛尿囊膜上，形成增殖性白色斑塊。?

病毒主要通過(guò)直接密切接觸和性接觸傳播。HSV經(jīng)口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破損皮膚等多種途徑侵入機(jī)體。人感染非常普遍，感染率達(dá)80～90%，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)是粘膜或皮膚局部集聚的皰疹，偶而也可發(fā)生嚴(yán)重的全身性疾病，累及內(nèi)臟。?

6個(gè)月以內(nèi)嬰兒多從母體通過(guò)胎盤獲得抗體，初次感染約90%無(wú)臨床癥狀，多為隱性感染。原發(fā)感染常發(fā)生于1～15歲，常見(jiàn)的有齦口炎，系在口頰粘膜和齒齦處發(fā)生成群皰疹，破裂后，多蓋一層壞死組織。此外可引起唇皰疹、濕疹樣皰疹、皰疹性角膜炎、皰疹性腦炎等。生殖器皰疹多見(jiàn)于14歲以后，比較嚴(yán)重，局部劇痛，伴有發(fā)熱全身不適及淋巴結(jié)炎。?

HSV原發(fā)感染產(chǎn)生免疫力后，部分病毒可沿神經(jīng)髓鞘到達(dá)三叉神經(jīng)節(jié)和脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中或周圍星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，以潛伏狀態(tài)持續(xù)存在，與機(jī)體處于相對(duì)平衡，不引起臨床癥狀。當(dāng)機(jī)體發(fā)熱、受寒、日曬、月經(jīng)、情緒緊張，使用垂體或腎上腺皮質(zhì)激素，遭受某些細(xì)菌病毒感染等，潛伏的病毒激活增殖，沿神經(jīng)纖維索下行至感覺(jué)神經(jīng)末梢，至附近表皮細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)增殖，引起復(fù)發(fā)性局部皰疹。其特點(diǎn)是每次復(fù)發(fā)病變往往發(fā)生于同一部位。最常見(jiàn)在唇鼻間皮膚與粘膜交界處出現(xiàn)成群的小皰疹。皰疹性角膜炎、皰疹性宮頸炎等亦可反復(fù)發(fā)作。?

HSV通過(guò)胎盤感染，影響胚胎細(xì)胞有絲分裂，易發(fā)生流產(chǎn)、造成胎兒畸形、智力低下等先天性疾病。約40～60%的新生兒在通過(guò)感染的產(chǎn)道時(shí)可被感染，出現(xiàn)高熱、呼吸困難和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，其中60～70%受染新生兒可因此而死亡，幸存者中后遺癥可達(dá)95%。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明在于通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，確定了一段單純皰疹病毒HSV的DNA序列及其PCR引物，該序列和相應(yīng)的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法進(jìn)行一段單純皰疹病毒的診斷。?

本發(fā)明的技術(shù)方案為：?

本發(fā)明確定了長(zhǎng)度為217bp的一段單純皰疹病毒（HSV）DNA序列及其引物，用所述的?引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列如下：?

GTCTGTTTGG?GCTTGTCGTT?ATGGGAGCCT?GGGGGGCGTG?GGGTGGGTCA?CAGGCAACCG?????60?

AATATGTTCT?TCGTAGTGTT?ATTGCCAAAG?AGGTGGGGGA?CATACTAAGA?GTGCCTTGCA????120?

TGCGGACCCC?CGCGGACGAT?GTTTCTTGGC?GCTACGAGGC?CCCGTCCGTT?ATTGACTATG????180?

CCCGCGTAGA?CGGAATATTT?CTTCGCTATC?ACTGCCC?????????????????????????????217?

擴(kuò)增PCR引物為：?