[發明專利]一種快速測定膠原蛋白含量的方法

無效

• 申請號: 201210513484.0
• 申請日: 2012-12-05
• 公開（公告）號: CN103018185A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 荊曉麗
• 申請（專利權）人: 青島艾華隆生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種膠原蛋白檢測技術，具體涉及一種快速測定膠原蛋白含量的方法。

背景技術

膠原蛋白是一種生物性高分子物質，主要存在于動物組織中，是生物科技產業重要的原材料之一，其應用領域包括生醫材料、化妝品、食品、保健品和科學研究。且隨著近年來人們生活水平的提高和保健意識的加強，膠原蛋白在化妝品、食品和保健品中的應用逐年提高，因此膠原蛋白含量的檢測顯得尤為重要。

目前膠原蛋白樣品的預處理方法主要是酸處理法，需要在高溫（110~130℃）下水解4~24小時后才能進行檢測，不僅反應時間長，準確度低，而且存在安全隱患，因此建立一種簡單、快速、安全、準確度高的膠原蛋白的檢測方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是解決現有技術存在檢測時間長、準確度低且存在安全隱患的技術問題，提供一種快速測定膠原蛋白含量的方法，該方法操作簡單，結果準確，無任何安全隱患。本發明涉及一種膠原蛋白含量的測定方法，其原理是利用膠原蛋白能被堿性蛋白酶酶解成羥脯氨酸，而羥脯氨酸能被氯胺T氧化生成吡咯環的物質，該吡咯環物質被二甲基氨基苯甲醛顯色，生成紅色化合物。具體操作步驟如下：

(1)?羥脯氨酸標準溶液的制備：吸取1mg/mL的羥脯氨酸儲存液10mL到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容到100mL，濃度為100μg/mL，分別吸取3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL，用蒸餾水定容到100mL，配制成濃度分別為3.0、6.0、9.0、12.0、15.0μg/mL的標準液；

(2)?待測樣品預處理：取樣品粉末5～20mg于具塞試管中，在70℃水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解1～3小時后，定容至100mL備用；

(3)?空白樣品：所述的水或緩沖液作為空白樣品，其蛋白質濃度為0mg/mL；

(4)?分別吸取步驟(1)中的標準液和步驟(2)中的待測樣品1mL，加入1mL檸檬酸緩沖液和1mL氯胺T溶液在25℃水浴中氧化20?分鐘后，加入高氯酸1mL，于25℃水浴中放置10?分鐘，加入對二甲基氨基苯甲醛1mL，65℃水浴顯色20?分鐘，冷卻后測吸光度值，并換算出樣品中羥脯氨酸的濃度，從而得到樣品中膠原蛋白的含量。

本發明的方法具有檢測方便、測量速度快、準確度高且操作條件溫和等優點；本發明的方法靈敏度高，可測到0.05mg/mL；精確度高，RSD≤2%，很適合進行食品、化妝品和保健品中膠原蛋白含量的快速檢測，具有廣泛的應用前景。

具體實施方式

實施例1：魚皮膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測定

(1)?羥脯氨酸標準溶液的制備：吸取1mg/mL的羥脯氨酸儲存液10mL到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容到100mL，濃度為100μg/mL，吸取此溶液3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL，分別用蒸餾水定容到100mL，即得濃度分別為3.0、6.0、9.0、12.0、15.0μg/mL的標準溶液；

(2)?標準曲線的制作：取上述標準液1mL，加入1mL檸檬酸緩沖液和1mL氯胺T溶液在25℃水浴中氧化20分鐘后，加入高氯酸1mL，于25℃水浴中放置10?分鐘，加入對二甲基氨基苯甲醛1mL，65℃水浴顯色20?分鐘，冷卻后測吸光度值，根據羥脯氨酸濃度與測得的相應羥脯氨酸吸光度值之間的關系繪制標準曲線；

(3)?樣品中膠原蛋白含量測定：取膠原蛋白樣品粉末20mg于具塞試管中，在70℃水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解3小時后，定容至100mL，取1mL水解液，按照羥脯氨酸標準曲線制作方法進行測定，測定的吸光度值與羥脯氨酸標準曲線之間的對應關系確定待測樣品中膠原蛋白的含量。

實施例2：魚骨膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測定

樣品中膠原蛋白含量測定：取膠原蛋白樣品粉末約10mg于具塞試管中，在70℃水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解2小時后，定容至100mL，取1mL水解液，按照羥脯氨酸標準曲線制作方法進行測定，測定的吸光度值與羥脯氨酸標準曲線之間的對應關系確定待測樣品中膠原蛋白的含量。其余同實施例1。

實施例3：保健品膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測定

樣品中膠原蛋白含量測定：取膠原蛋白樣品粉末約5mg于具塞試管中，在70℃水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解1小時后，定容至100mL，取1mL水解液，按照羥脯氨酸標準曲線制作方法進行測定，測定的吸光度值與羥脯氨酸標準曲線之間的對應關系確定待測樣品中膠原蛋白的含量。其余同實施例1。

上述實施例只是為了說明本發明，而不是對本發明的限制，所有在本發明的實質范圍內作出的變化、改型、添加或替換，都應屬于本發明的保護范圍。