[發(fā)明專(zhuān)利]檢測(cè)雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210512577.1
• 申請(qǐng)日: 2012-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102952887A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張慧;姜侃;陳小珍;汪新
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 浙江杭州金通專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種檢測(cè)雪白絲衣霉菌(Byssochlamys?nivea)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物、熒光探針、PCR緩沖液、dNTP混合物、MgCl₂和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸組成，它們的摩爾比為1:1:1:1混合，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物：5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′

下游引物：5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′

熒光探針：5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′

其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)。

2.一種檢測(cè)雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

（1）提取樣品DNA；

（2）以待測(cè)樣品DNA為模板，與權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒混合配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；

（3）選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，基線(xiàn)調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線(xiàn)；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線(xiàn)超過(guò)閾值線(xiàn)，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，小于Ct值，則判斷為陽(yáng)性，所述Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

3.如權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述Ct值為35。

4.如權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述方法的步驟（2）中PCR體系終濃度組成如下：

??試劑名稱(chēng)??終濃度??PCR反應(yīng)緩沖液??1×

??MgCl₂??2.0～3.5mmol/L??dNTP混合物??0.2～0.4mmol/L??上游引物??0.2～0.4μmol/L??下游引物??0.2～0.4μmol/L??熒光探針??0.2～0.4μmol/L??DNA聚合酶??1～3U/反應(yīng)??DNA模板??1～10²ng/μL??溶劑為無(wú)菌超純水