[發明專利]一種含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針及應用無效
| 申請號： | 201210512569.7 | 申請日： | 2012-12-04 |
| 公開（公告）號： | CN103012418A | 公開（公告）日： | 2013-04-03 |
| 發明（設計）人： | 趙寶祥;苗俊英;張尚立;呂洪水;劉靜 | 申請（專利權）人： | 山東大學 |
| 主分類號： | C07D491/107 | 分類號： | C07D491/107;C09K11/06;G01N21/64 |
| 代理公司： | 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221 | 代理人： | 李健康 |
| 地址： | 250061 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 噁二唑 結構 單元 羅丹 ph 熒光 探針 應用 | ||
技術領域
本發明涉及一種含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針及其作為活細胞內pH熒光探針的應用。?
背景技術
細胞中如細胞新陳代謝、信號傳導、細胞生長、凋亡和自噬等重要的生理過程都與pH值緊密相關。細胞中pH值的微小變化就會導致細胞功能紊亂，影響機體生理功能從而導致多種疾病，如癌癥、阿爾茨海默氏病等的發生。細胞中的溶酶體具有弱酸性環境(pH4.5–5.5)，其中包含大量的水解酶和分泌蛋白，具有重要的功能。因此，監測活細胞中pH值的變化對于研究細胞功能及生理和病理過程是必須的。?
羅丹明B具有量子產率高、摩爾消光系數大、光穩定性好、背景干擾少等優點，其衍生物被廣泛應用于“關-開”型金屬離子熒光探針。羅丹明B類探針通常包含一個螺內酰胺或螺內酯結構。在中性及堿性溶液中，螺環結構保持不變，溶液為無色且不發熒光；在酸性溶液中，螺環結構打開，溶液呈現紅色并發出強熒光。這些性質使羅丹明B衍生物非常適合用來檢測酸性pH。盡管目前已有部分報道的羅丹明B類pH探針用于監測溶酶體中的pH值，但這些探針往往會引起“堿性效應”，即長時間孵化后會引起溶酶體內的pH值升高，影響監測結果。因此設計合成新型羅丹明B類pH熒光探針具有重要的意義。?
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針及其作為活細胞內pH熒光探針的應用。?
本發明所述含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針，其結構如式（I）所示：?
上述含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針的合成方法，步驟如下：由羅丹明B的N-對甲苯磺酸乙酯衍生物(1)與2-氨基-5-苯基-1,3,4-噁二唑(2)，以碳酸鉀為堿，在乙腈中回流2±0.5小時，經柱層析純化即得到如式(I)所示的含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針(3)，產率82.7%。?上述合成路線反應式如下：?
本發明所述含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針在活細胞內監測pH值變化及特異性標記溶酶體的應用。?
其中：所述活細胞優選Hela細胞或HUVEC細胞。?
本發明所述含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針對H+響應迅速，有很高的靈敏度和選擇性，并且具有良好的可逆性。其作為活細胞內的pH熒光探針可以有效監測活細胞內pH值變化及特異性標記溶酶體和監測溶酶體內pH值變化。?
具體實驗驗證：配制本發明所述含1,3,4-噁二唑結構單元的羅丹明B類pH熒光探針（以下簡稱：探針3）在梯度pH值（3.72～7.21）下的溶液（乙醇/Britton-Robinson緩沖溶液，40mM醋酸，磷酸，硼酸，1:9,體積比，0.1M?NaCl），通過紫外可見分光光度法和熒光分光光度法測試其對不同pH值的響應能力。?
在酸性和弱堿性條件下向探針3的溶液中分別定量加入NaNO3,KNO3,Mg(NO3)2·6H2O,Al(NO3)3·9H2O,Ca(NO3)2·4H2O,Fe(NO3)3·9H2O,Co(NO3)2·6H2O,Ni(NO3)2·6H2O,Cu(NO3)2·3H2O,Zn(NO3)2·6H2O,AgNO3,Cd(NO3)2·4H2O,Pb(NO3)2,HgCl2的水溶液，測試其抗干擾能力。?
使用不同濃度的上述探針3加入到Hela細胞，分別在不同孵化時間進行熒光成像，觀察細胞內熒光強度變化。?
使用上述探針3與商品化的溶酶體探針Green?DND-189對活Hela細胞共染色，通過熒光成像進行染色定位。?
