[發(fā)明專利]誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑及培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210512048.1
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102994446A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅國安;王義明
• 申請（專利權(quán)）人: 羅國安
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 張秋越

1.一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有丹酚酸B。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，還含有人參皂苷Rg1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑，其特征在于，還含有人參總皂苷。

4.一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基通過以下方法制得：將權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)劑加入用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導(dǎo)劑中的丹酚酸B在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為10^-6~10^-3?M。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成：GMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，100mM的丙酮酸鈉水溶液和10^-1M的二巰基乙醇水溶液，其中GMEM培養(yǎng)基:胎牛血清:非必需氨基酸:丙酮酸鈉水溶液:?二巰基乙醇水溶液的體積比=77.9:20:1:1:0.1。

6.一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基通過以下方法制得：將權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)劑加入用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導(dǎo)劑中的丹酚酸B在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為10^-6~10^-3?M，人參皂苷Rg1在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為5×10^-6?~10^-3M。

7.一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基通過以下方法制得：將權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)劑加入用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導(dǎo)劑中的丹酚酸B在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為10^-6~10^-3M，人參總皂苷在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為7.8μg/mL~1.5mg/mL。

8.權(quán)利要求1~3任一項所述的誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，包括：胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)形成擬胚體，取擬胚體于含有所述誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，獲得心肌細(xì)胞。

9.權(quán)利要求4~7任一項所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，包括：

??1）將胚胎干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液；

??2）懸滴培養(yǎng)：將單細(xì)胞懸液細(xì)胞計數(shù)后用分化培養(yǎng)基將其稀釋成細(xì)胞濃度為10³~10⁵cells/mL的胚胎干細(xì)胞懸液，接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)表面上，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子，使蓋子上的胚胎干細(xì)胞形成懸滴，培養(yǎng)皿中加入水或水溶液以保持懸滴在孵育過程中的濕度，培養(yǎng)皿置于5%?CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~3天；?

3）懸浮培養(yǎng)：收集步驟2）培養(yǎng)皿蓋子上懸滴中形成的擬胚體，將其轉(zhuǎn)移到盛有分化培養(yǎng)基的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)懸浮，促使擬胚體進(jìn)一步增殖；

4）?將步驟3）制備好的擬胚體轉(zhuǎn)移到明膠包被的孔板，每孔一個擬胚體添加所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，開始干預(yù)分化培養(yǎng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2）和步驟3）中所述分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成：GMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，100mM的丙酮酸鈉水溶液和10^-1M的二巰基乙醇水溶液，其中，GMEM培養(yǎng)基:胎牛血清:非必需氨基酸:丙酮酸鈉水溶液:?二巰基乙醇水溶液的體積比=77.9:20:1:1:0.1。