[發(fā)明專利]一種檢測H5N1亞型禽流感病毒的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210511072.3
• 申請日: 2012-12-03
• 公開（公告）號: CN102998447A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝芝勛;黃嬌玲;羅思思;謝志勤;謝麗基;劉加波;龐耀珊;范晴
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577;G01N27/26;G01N27/327
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測H5N1亞型禽流感病毒的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)

禽流感(Avian?influenza,AI)不僅嚴(yán)重的影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展，而且危害人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，自2003年11月2012年11月,H5N1感染人類的病例為606例，死亡357例，死亡率高達(dá)58.9%。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測H5N1的方法對于防控H5N1型病毒的傳播具有重要的意義。

目前，用于檢測AIV的方法有病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、血凝(HA)和血凝抑制(HI)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、熒光定量RT-PCR、以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)。ELISA、熒光定量RT-PCR、NASBA和LAMP等方法能夠檢測出各種樣品中的AIV，但這些方法或特異性差、或敏感性低、或操作復(fù)雜、或需要昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)的技術(shù)人員。

電化學(xué)免疫傳感器將電化學(xué)分析方法和免疫分析相結(jié)合，既具備了電化學(xué)分析特有的檢測快速、操作簡單、靈敏度高、可微型化等優(yōu)點，也具有免疫反應(yīng)中特有的抗原-抗體特異性結(jié)合的特點。目前電化學(xué)免疫傳感器已經(jīng)成功應(yīng)用于環(huán)境分析、食品工業(yè)和臨床醫(yī)學(xué)。石墨烯由于具有大的比表面積、好的導(dǎo)電能力，在電化學(xué)傳感器的研究中已經(jīng)得到很廣泛的應(yīng)用。但是氧化石墨烯由于其表面帶有豐富的羧基、羥基和環(huán)氧基等含氧基團(tuán)，使其具有很好的相容性，卻破壞了原來石墨的SP2雜化體系，導(dǎo)致氧化石墨烯的導(dǎo)電性與石墨相比差很多，因此很大程度上限制它在電化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測H5N1亞型禽流感病毒的復(fù)合物。

本發(fā)明提供的一種用于檢測H5N1亞型禽流感病毒的復(fù)合物，為將H5N1亞型禽流感病毒抗體A和牛血清白蛋白（BSA）均與氧化石墨烯通過酰胺鍵連接，得到抗體A-氧化石墨烯-BSA復(fù)合物。

上述復(fù)合物中，所述H5N1亞型禽流感病毒抗體A為H5N1亞型禽流感病毒的多克隆抗體，在實施例中具體為鼠抗H5N1亞型禽流感病毒多克隆抗體。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備用于檢測H5N1亞型禽流感病毒復(fù)合物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1）將氧化石墨烯、EDC、NHS和水混合，活化，得到活化后氧化石墨烯；

2）將所述活化后氧化石墨烯、H5N1亞型禽流感病毒抗體A、BSA和水混勻，反應(yīng)，即得到用于檢測禽流感病毒的復(fù)合物。

上述方法中，

步驟1）中，所述氧化石墨烯、所述EDC和所述NHS的質(zhì)量比為0.4:5：6；

步驟2）中，所述活化后氧化石墨烯、所述H5N1亞型禽流感病毒抗體A和所述BSA的質(zhì)量比為400：1：20。

上述方法中，

步驟1）中，所述活化的時間為8－12min，所述活化的溫度為25－28℃；

步驟2）中，所述反應(yīng)的溫度為25-28℃，所述反應(yīng)時間為12-14h。

上述方法中，

所述H5N1亞型禽流感病毒抗體A為H5N1亞型禽流感病毒的多克隆抗體，在實施例中具體為鼠抗H5N1亞型禽流感病毒多克隆抗體。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測H5N1亞型禽流感病毒的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的用于檢測H5N1亞型禽流感病毒的復(fù)合物和電化學(xué)免疫傳感器；

所述電化學(xué)免疫傳感器包括工作電極、參比電極和對電極；

所述工作電極按照如下方法制備：

1）將金電極用硫脲修飾，得到硫脲修飾金電極（簡寫為：硫脲-金電極）；

2）將所述硫脲修飾金電極通過電化學(xué)還原HAuCl₄沉積金納米粒子，得到金納米粒子修飾硫脲-金電極（簡寫為：金納米粒子-硫脲-金電極）；

3）將所述金納米粒子修飾的硫脲-金電極與H5N1亞型禽流感病毒抗體B結(jié)合，得到抗體B修飾金納米粒子-硫脲-金電極（簡寫為：抗體B-金納米粒子-硫脲-金電極）；

4）將所述抗體B修飾金納米粒子-硫脲-金電極用BSA封閉非特異性活性位點，得到BSA封閉的抗體B-金納米粒子-硫脲-金電極，即為工作電極。

上述試劑盒中，

所述電化學(xué)免疫傳感器的工作電極的制備方法中，