[發(fā)明專利]一種豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210509229.9
• 申請(qǐng)日: 2012-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102989010A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李朝陽(yáng);李明義;石喬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東信得科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 北京恒都律師事務(wù)所 11395
• 代理人: 邸建凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗。?

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉(Porcine?epidemic?diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible?gastroenteritis?virus，TGEV)同屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，兩種病毒感染后所引起的臨床癥狀極其相似，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。?

PEDV經(jīng)口鼻感染后直接進(jìn)入小腸，在小腸上皮細(xì)胞增殖，引起小腸絨毛吸收上皮細(xì)胞變性、損傷、脫落和小腸絨毛萎縮，導(dǎo)致腸內(nèi)酶活性降低，吸收功能障礙，腸道內(nèi)滲透壓增高，引起滲透性腹瀉。造成掉膘、降低飼料利用率，浪費(fèi)藥物和人力等所造成的經(jīng)濟(jì)損失是非常嚴(yán)重的。該病是世界性的疾病之一，亞洲、歐洲以及美洲等國(guó)家的許多豬陽(yáng)性率都有很高。

M蛋白是由226個(gè)氨基酸組成、分子質(zhì)量為27KD～32KD的膜糖蛋白，在病毒粒子的組裝和出芽過(guò)程中具有重要作用。M蛋白在感染細(xì)胞中位于高爾基體內(nèi)，不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端區(qū)、病毒囊膜中大的C末端區(qū)和中間為α螺旋區(qū)。在補(bǔ)體存在的條件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的單克隆抗體能中和病毒的感染性。另外，M蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α干擾素，所以M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原。

乳酸乳球菌是人和大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)的常見(jiàn)細(xì)菌，因其在食品工業(yè)各個(gè)領(lǐng)域中的長(zhǎng)期應(yīng)用已證明不具有致病性，被公認(rèn)為安全級(jí)微生物。利用一些乳酸乳球菌在胃腸道、泌尿、生殖系統(tǒng)中或黏膜部位粘附存活且無(wú)病原性等特點(diǎn)，廣泛開(kāi)展了活菌口服后在體內(nèi)定植及疫苗的研究。

然而，現(xiàn)有的疫苗一般需要注射，常規(guī)注射疫苗會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激及疫苗吸收的問(wèn)題，而通過(guò)口服免疫時(shí)，免疫原在到達(dá)小腸粘膜之前會(huì)存在被降解或滅活的可能，雖然以細(xì)菌病毒為活載體可達(dá)到這一目的，但細(xì)菌病毒對(duì)人體會(huì)有一定的傷害性，且不能在腸道粘膜定居。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種安全無(wú)毒，能在腸道粘膜定居的豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗。?

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

它是保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為乳酸乳球菌?MG1363/pMG36e-M??CCTCC?M?2012354；保藏名稱：一種豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗：乳酸乳球菌?MG1363/pMG36e-M　lactococcus?lactis?MG1363/pMG36e-M；保藏日期2012.9.16；保藏單位地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗的制備方法的有益效果是：可以口服，口服免疫的優(yōu)點(diǎn)是可有效地刺激腸道局部免疫細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA，這尤其適應(yīng)于腸道粘膜傳染病，避免了常規(guī)注射疫苗所引起的應(yīng)激及疫苗吸收問(wèn)題，但口服免疫需要克服免疫原在到達(dá)小腸粘膜之前被降解或滅活的可能，滿足這一要求的必須是活的載體系統(tǒng)來(lái)傳遞完整無(wú)損的抗原成分。以細(xì)菌病毒為活載體均可達(dá)到這一目的，但作為安全無(wú)毒，能在腸道粘膜定居的活載體系統(tǒng)，乳酸乳球菌是最合適的載體系統(tǒng)?？诜呙缤ㄟ^(guò)胃腸黏膜進(jìn)行抗原遞呈，可經(jīng)不同的免疫通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1為酶切鑒定結(jié)果圖；?

圖2為Western?blot分析結(jié)果圖；

圖3為凍干曲線圖。

具體實(shí)施方式

請(qǐng)參閱圖1、圖2和圖3所示，本發(fā)明的一種豬流行性腹瀉病毒基因工程亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：?

1).合成M基因

將合成M基因連接到PES載體上，按照合成序列說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切，分別克隆至pMD18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，OMEGA試劑盒小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒（見(jiàn)圖1）；

2).表達(dá)載體的構(gòu)建