[發(fā)明專利]一種提高肝片吸蟲Cat L1（FhCat L1）DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210508855.6
• 申請(qǐng)日: 2012-12-03
• 公開（公告）號(hào): CN103083684A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅洪林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/00;A61K47/42;C12N15/12;C12N15/79;A61P33/12
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 康海燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高抗肝片吸蟲FhCat?L1?DNA疫苗免疫保護(hù)率的方法。具體涉及利用樹突狀細(xì)胞(DC)表面分子DEC-205的單鏈抗體scFv^NLDC-145靶向DC細(xì)胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat?L1基因的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高抗肝片吸蟲Cat?L1?DNA疫苗的免疫保護(hù)率。?

背景技術(shù)

肝片吸蟲是一種寄生性蠕蟲，能引起牛、羊等反芻動(dòng)物及人的嚴(yán)重吸蟲病[1]。在世界范圍內(nèi)，肝片吸蟲病直接影響著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康，據(jù)估計(jì)每年可造成約20億美元的經(jīng)濟(jì)損失[2]，是一種不可忽視的重要人畜共患寄生蟲病。對(duì)此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化學(xué)藥物，但這些藥物只對(duì)早期的未成熟蟲體或成蟲具有良好效果，對(duì)感染后期的治療不佳。最近發(fā)現(xiàn)，家畜已對(duì)三氯苯咪唑等化學(xué)藥物產(chǎn)生耐藥性[3-5]。同時(shí)，人們對(duì)畜產(chǎn)品中化學(xué)藥物殘留量的要求也越來(lái)越嚴(yán)格，這給利用化學(xué)藥物控制吸蟲病帶來(lái)極大困難。因此，防治吸蟲病急切需要一種能替代化學(xué)藥物的治療方法，?這就給疫苗發(fā)展帶來(lái)了良好契機(jī)[6]。?

事實(shí)上，到目前為止，有很多肝片吸蟲的疫苗候選分子如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）,?亮氨酸氨肽酶(LAP),?脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）及組織蛋白酶?L（Cat?L）被用于開發(fā)諸如重組蛋白疫苗及DNA疫苗，雖然這些疫苗能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和大動(dòng)物上產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)[7，8]，但至今仍沒有一種商品化疫苗能投入到臨床生產(chǎn)，這在很大程度上受制于疫苗的保護(hù)率低下的現(xiàn)狀，而這種現(xiàn)狀與如何提高抗原的呈遞有著密切的關(guān)系[9-12]。理想的疫苗應(yīng)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，并能誘導(dǎo)長(zhǎng)期持久的免疫記憶以保護(hù)機(jī)體免受疾病侵襲。作為一種成功的疫苗，其抗原可被抗原提呈細(xì)胞?（antigen?presenting?cells，APC）所提呈，并激活機(jī)體免疫系統(tǒng)引起抗原特異性免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞（DC）是已知體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，其最大的特點(diǎn)是能夠刺激初始T細(xì)胞增殖和啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)。單鏈抗體是一種分子量小，穿透力強(qiáng)，可避免非特異性細(xì)胞毒性及免疫原性，目前被認(rèn)為是最為理想的具有體內(nèi)特異性導(dǎo)向作用的載體片段[13，14]。DEC205?作為小鼠?DC?表面特異性標(biāo)志，DEC205?抗體?NLDC-145?具有特異靶向?DC?的作用，是體內(nèi)?DC?修飾的理想載體。所以抗?DEC205?的單鏈抗體可將特定抗原定向呈遞給DC，激活初始免疫細(xì)胞，使抗原提呈給T細(xì)胞，引起有效的抗原特異性免疫反應(yīng)。?

組織蛋白酶L是一種半胱氨酸蛋白酶，通常情況下這種酶以非活性狀態(tài)存在于分泌囊泡的腸上皮細(xì)胞中[15，16]，當(dāng)前體酶活化并被釋放后，?寄生蟲即可利用活化的組織蛋白酶行使多種重要的功能，如能在肝臟中將蛋白分解為多肽從而利于營(yíng)養(yǎng)的吸收、降解基質(zhì)蛋白從而有利于寄生蟲從腸道遷移到肝臟[17，18]。研究還表明，組織蛋白酶L還在免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白從而破壞宿主的免疫攻擊，并能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活性、抑制Th1免疫反應(yīng)[19-21]。?

目前，對(duì)肝片吸蟲組織蛋白酶L的疫苗開發(fā)主要集中在重組蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重組肝片吸蟲組織蛋白酶L具有與天然蛋白相似的功能[22]，且在荷斯坦牛身上免疫后獲得了48.2%的減蟲率和顯著升高的總IgG?[23]。在DNA疫苗的研究中，肝片吸蟲Cat?L?DNA疫苗免疫大鼠能獲得70%的免疫保護(hù)?[24]。然而，要想開發(fā)出高效率的抗肝片吸蟲的疫苗，這樣的免疫保護(hù)率仍顯不足。因此，如何提高疫苗的保護(hù)率就成了目前疫苗開發(fā)的熱點(diǎn)。?

本發(fā)明正是著眼于提高肝片吸蟲Cat?L1?DNA疫苗的免疫保護(hù)率，從提高其抗原在樹突狀細(xì)胞中的呈遞作用入手，利用樹突狀細(xì)胞(DC)的表面分子DEC-205的單鏈抗體scFv^NLDC-145能靶向DC細(xì)胞的重要作用機(jī)理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat?L1基因的DNA疫苗后對(duì)肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高肝片吸蟲Cat?L1?DNA疫苗的免疫保護(hù)率。?

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)肝片吸蟲疫苗保護(hù)率和疫苗抗原呈遞效率低下的現(xiàn)狀，本發(fā)明主要著眼于提供一種利用DC特異性單鏈抗體提高肝片吸蟲Cat?L1（FhCat?L1）DNA疫苗免疫保護(hù)率的新方法，用于指導(dǎo)抗肝片吸蟲DNA疫苗的研發(fā)。?

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：?

一種提高肝片吸蟲Cat?L1（FhCat?L1）免疫保護(hù)率的方法，所述方法包括以下步驟：?