[發(fā)明專利]一種對懸浮細胞的肌動蛋白絲進行染色的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210508771.2
• 申請日: 2012-12-03
• 公開（公告）號: CN103063499A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李琳;嚴興洪
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，尤其涉及一種對懸浮細胞的肌動蛋白絲進行染色的方法。?

背景技術(shù)

肌動蛋白絲(actin?filament)由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成的纖絲，是細胞骨架的主要成分之一。肌動蛋白絲和它的結(jié)合蛋白(association?protion)以及肌球蛋白(myosin)三者構(gòu)成化學機械系統(tǒng)，利用化學能產(chǎn)生機械運動，對細胞貼附、鋪展、運動、內(nèi)吞、細胞分裂等許多細胞功能具有重要作用。在高等動物的生命活動過程中，細胞的定向運動與胚胎發(fā)育、傷口愈合、免疫應(yīng)答、組織發(fā)育等活動都密切相關(guān)。此外，人類許多重大疾病，如腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等，也與細胞運動息息相關(guān)。因此，為了直觀的觀察肌動蛋白絲在行事以上各功能時的結(jié)構(gòu)，各類細胞中肌動蛋白絲的著色觀察成為研究的熱點。?

肌動蛋白絲的著色方法主要有固定染色和顯微注射兩種，可以階段性或者持續(xù)性地觀察肌動蛋白絲的結(jié)構(gòu)變化。因為懸浮細胞個體小，又不能貼壁生長，所以這兩種方法都不能對懸浮細胞的肌動蛋白絲進行很好地標記。為了解決懸浮細胞不貼壁的問題，許多學者雖然做了培養(yǎng)附著基質(zhì)的改良，比如增加涂層(多聚賴氨酸)，構(gòu)建三維框架等方法。但是現(xiàn)實中總有一些細胞很難貼壁生長，因此，需要一種能簡便、快速的染色方法可以對這類細胞的肌動蛋白絲進行著色。?

本人在對紫菜的一種無性生殖孢子(單孢子)的研究過程中發(fā)現(xiàn)，這類生殖孢子放散出來后渾圓、沒有細胞壁、個體小(直徑為10-20μm)而且在?一段時間內(nèi)(約1-2小時)很難貼壁生長，總是漂浮在海水中。鑒于這類細胞與懸浮細胞的性質(zhì)相似，因此對于單孢子的染色方法應(yīng)該可以推廣到懸浮動物細胞的染色中。?

發(fā)明內(nèi)容

由于懸浮細胞在培養(yǎng)過程中很難貼壁生長，不能按照貼壁細胞的著色方法操作，本發(fā)明旨在解決懸浮細胞肌動蛋白絲的染色問題，以便于對懸浮細胞肌動蛋白絲進行觀察。?

本發(fā)明提供一種對懸浮細胞的肌動蛋白絲進行染色的方法，包括以下步驟：A)收集懸浮細胞，通過離心的方法對單孢子進行收集，在800～1000rpm條件下離心收集需要染色的懸浮細胞；B)配置染色液，用微絲緩沖液稀釋肌動蛋白絲的熒光標記物質(zhì)Alexa?Fluor?488?phalloidin至5U?mL^-1，添加體積百分含量為2％的甘油以增強染色效果，其中所述微絲緩沖液包括100mM?PIPES、10mMEGTA、5mM?MgSO₄和0.3M?mannitol，所述微絲緩沖液的pH為6.9；C)將收集到的細胞懸浮到上述染色液中，在室溫、黑暗條件下染色10分鐘后，重新在800～1000rpm條件下離心收集細胞。?

本發(fā)明還提供一種對使用上述方法進行染色的懸浮細胞的肌動蛋白絲進行觀察的方法，其特征在于，用磷酸緩沖液對收集到的細胞重新離心洗滌一次，將再次收集到的細胞置于載玻片上進行觀察。所述磷酸緩沖液濃度為0.01M，pH為7.4?

為了減少熒光物質(zhì)的淬滅，在觀察時還可以向載玻片上被觀察的染色細胞加入體積百分含量為4％的沒食子酸丙酯，其中溶劑使用90％甘油和10％磷酸緩沖液配成的溶液。?

通過實際染色觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)可以對單孢子的肌動蛋白絲進行很好的標記，而且離心的過程可以去除細胞碎片和多余的染色液，使觀察結(jié)果變得更加清晰明了。?

附圖說明

圖1a示出的是傳統(tǒng)技術(shù)中在蓋玻片上附著單孢子肌動蛋白絲進行染色后在顯微鏡的明場環(huán)境下觀察的效果圖。?

圖1b示出的是傳統(tǒng)技術(shù)中在蓋玻片上附著單孢子肌動蛋白絲進行染色后在顯微鏡的熒光環(huán)境下觀察的效果圖。?

圖2a示出的是按本發(fā)明實施例二提供的方法對單孢子肌動蛋白絲進行離心染色后在顯微鏡的明場環(huán)境下觀察的效果圖。?

圖2b示出的是按本發(fā)明實施例二提供的方法對單孢子肌動蛋白絲進行離心染色后在顯微鏡的熒光環(huán)境下觀察的效果圖。?

具體實施方式

實施例一?