[發明專利]嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用

無效

• 申請號: 201210508727.1
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102994639A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 王忠舉
• 申請（專利權）人: 王忠舉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 畢進

技術領域

本發明主要涉及海產品疾病檢測技術領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用。

背景技術

我國海域遼闊，自然條件優越，海洋資源十分豐富。但目前開發利用的程度還很低。這也說明我國開發利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業資源寶庫，其盛產水生動物、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經濟發展。加強多邊和雙邊的海洋開發國際合作，集中集約開發利用海域及海島資源，合理配置優勢海洋產業，科學高效開發海洋資源，積極開展科研與試驗、開發與利用，海水養殖標準化是合理開發海水養殖資源的重要手段，研究制定海產品養殖標準，合理開發海水灘涂養殖資源，提高養殖海產品疾病是當今養殖業的重點內容。海產品養殖是一項高風險的養殖業，傳統的小戶的海產品養殖給養殖戶帶來了巨大的市場和技術風險。為了將養殖戶養殖風險降到最低，開展對各類養殖業，包括魚、蝦、蟹、水生動物、鮑魚、貝類、海藻等各類海產品的疾病防治工作任務舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等有害細菌，是引起海產品各種疾病的罪魁禍首。

嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個相連。在普通瓊脂平板培養基上進行培養形成的菌落園形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發育良好。嗜水氣單胞菌在水溫14.0～40.5℃范圍內都可繁殖，以28.0～30.0℃為最適溫度。PH值在6～11范圍內均可生長；最適PH值為7.27；嗜水氣單胞菌可在含鹽量0‰～4‰的水生存，最適鹽度為0.5‰。嗜水氣單胞菌可以產生毒性很強的外毒素，因嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，所以要特別注意療效。

發明內容

由背景技術可見，提高嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)的檢出率，增強其檢測精度是解決多種水生動物病害問題的重要途徑。本研究采用以下技術方案實現嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用，其包括下述步驟：

采用CTAB法提取樣品的核酸；以嗜水氣單胞菌核酸標準品作為陽性對照，對提取的樣品核酸進行PCR特異性擴增；對PCR特異性擴增產物進行電泳，對比樣品和陽性對照的結果判斷結果；

所述嗜水氣單胞菌核酸標準品的制備方法包括以下步驟：

將提取的嗜水氣單胞菌ATCC?35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC?7966的基因組核酸經冷凍干燥后獲得，其中所述的冷凍干燥條件為：啟動凍干機，當干燥室溫度降至-35℃時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至-40℃時，將在-80℃預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr結束冷凍；并將樣品于15℃干燥，當真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于-20℃中避光貯存。

對于上述技術方案中所述的樣品的核酸提取方法，可以由本領域技術人員根據共知常識確定。

在上述技術方案中，所述的提取樣品核酸的方法為步驟（3），所述嗜水氣單胞菌核酸標準品的制備方法包括以下步驟：

（1）增菌：從嗜水氣單胞菌標準菌株接種到普通LB培養基中，進行發酵，37℃培養12h制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，32~37℃培養24~48h，至菌懸液菌含量的終濃度為10⁷~10¹⁰cfu/g；

所述的嗜水氣單胞菌培養基，其配制方法如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g，無需調節pH，121℃下滅菌20min；冷卻備用；

（2）洗滌：將步驟（1）獲得的菌懸液重復下述操作2~5次以清洗，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合，在8000~12000rpm條件下離心5~10min，收集菌體；

（3）采用CTAB法提取菌懸液DNA；將提取的DNA用pH8.0的TE溶液溶解，獲得基因組核酸溶液；其操作步驟參見國家海洋局908專項辦公室編，海洋生物生態調查技術規程，海洋出版社，2006、4,p23-26，于西林瓶中分裝核酸樣品；