[發(fā)明專利]一種黃曲霉毒素B1液相色譜檢測(cè)用富集方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210507390.2
• 申請(qǐng)日: 2012-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN103018377A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李培武;喻理;張奇;丁小霞;張文;馬飛;張兆威
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號(hào): G01N30/08
• 分類號(hào): G01N30/08
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素B₁液相色譜檢測(cè)用富集方法。

背景技術(shù)

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的高毒性次生代謝產(chǎn)物。自從1960年的“火雞事件”開始，人們開始關(guān)注黃曲霉毒素，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素(AFT)有十幾種，其中以黃曲霉毒素B₁最常見、毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素廣泛存在于玉米、花生、棉籽、杏仁、無花果等農(nóng)產(chǎn)品和食品中，加之其污染情況可以發(fā)生在產(chǎn)前、產(chǎn)中、產(chǎn)后的多個(gè)環(huán)節(jié)，使得其成為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和食品安全的巨大威脅。為此世界各國(guó)建立各種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品和農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素總量(黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的總量)和黃曲霉毒素B₁的最大允許含量都做了強(qiáng)制性的規(guī)定。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB?2761-2011規(guī)定花生及其制品中黃曲霉毒素總量不得超過20?μg/kg，黃曲霉毒素B₁含量不得超過5?μg/kg。因此對(duì)食品和農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法的開發(fā)是目前科研人員的研究重點(diǎn)。

現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有薄層層析法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法三種。薄層層析法作為傳統(tǒng)方法，因?yàn)樾枰僮魅藛T長(zhǎng)時(shí)間暴露在有機(jī)溶劑和毒素中而逐漸被淘汰。酶聯(lián)免疫分析法作為最新的分析方法，克服了薄層層析法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員傷害大的缺點(diǎn)，且檢測(cè)快速方便，在過去20年中發(fā)展迅速。但是這種方法涉及對(duì)溫度敏感性強(qiáng)的抗體，且通常一種抗體只能測(cè)定一種黃曲霉毒素，在多種黃曲霉毒素待檢的情況下，可能存在交叉反應(yīng)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)，均制約了該方法的推廣和應(yīng)用。所以，目前最能被大家認(rèn)可的分析方法還是液相色譜分析法，它具有自動(dòng)化程度高，定量定性準(zhǔn)確，檢測(cè)種類多元的特點(diǎn)，一直是世界各國(guó)官方檢測(cè)方法。但是，目前針對(duì)黃曲霉毒素的高效液相色譜分析法均采用免疫親和柱來富集毒素，酶聯(lián)免疫分析法提及的抗體的缺點(diǎn)仍然無法避免，因此研究一種新的黃曲霉毒素B₁富集方法以擺脫抗體的缺點(diǎn)，并使其能在黃曲霉毒素B₁測(cè)中應(yīng)用，對(duì)于監(jiān)控食品和農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素B₁很重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種在黃曲霉毒素液相色譜檢測(cè)檢測(cè)中得以應(yīng)用的黃曲霉毒素B₁液相色譜檢測(cè)用富集方法。該富集方法可用于黃曲霉毒素B₁液相色譜檢測(cè)時(shí)的富集處理，操作簡(jiǎn)單，快速，結(jié)果可靠。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案如下：

一種黃曲霉毒素B₁液相色譜檢測(cè)用富集方法，其特征在于：它包括以下步驟：

（1）黃曲霉毒素B₁富集材料的制備：

在鱗片石墨中加入硫酸和磷酸組成的混酸及高錳酸鉀，進(jìn)行初步氧化反應(yīng)，然后通過水解反應(yīng)形成膨脹的氧化石墨，后用雙氧水、鹽酸和去離子水依次多次洗滌純化得到氧化石墨，然后將純化后的氧化石墨通過高強(qiáng)度的超聲解離成單層氧化石墨烯，再經(jīng)離心選取2000rpm離心30分鐘不沉降且在5000rpm離心30min沉降而得到的；

（2）將上述制備的黃曲霉毒素B₁富集材料加入待測(cè)樣品的甲醇水溶液中，所述體系中甲醇的含量按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)最高不超出體系總體積的12.5%，所述黃曲霉毒素B₁富集材料的質(zhì)量與體系總體積比至少要達(dá)到0.625g/mL，室溫混合，震蕩10-30min以進(jìn)行黃曲霉毒素B₁的富集，離心，去掉上清液，然后用甲醇進(jìn)行洗脫，以將黃曲霉毒素B₁富集材料中富集的黃曲霉毒素B₁洗脫至甲醇中，得到含黃曲霉毒素B₁的甲醇洗脫液，液相色譜檢測(cè)備用。

按上述方案，所述步驟（2）的體系在需要時(shí)加水進(jìn)行稀釋，以使體系中甲醇含量按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)最高不超出體系總體積的12.5%；所述待測(cè)樣品的甲醇水溶液用量為4-8mL。

按上述方案，所述步驟（2）中黃曲霉毒素B₁富集材料的質(zhì)量與體系總體積比優(yōu)選為0.625-0.75g/mL。

按上述方案，所述步驟（2）體系中黃曲霉毒素B₁的含量應(yīng)在0.8-100ng/mL范圍內(nèi)，如超出，可對(duì)待測(cè)樣品的甲醇水溶液進(jìn)行相應(yīng)濃縮或稀釋處理后再進(jìn)行富集。