[發明專利]胚源性神經干細胞原代細胞的分離及傳代培養方法

無效

• 申請號: 201210507111.2
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103013919A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 陸華
• 申請（專利權）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 何學成

1.一種胚源性神經干細胞原代細胞分離及傳代培養方法，其特征在于，其采用無血清培養和單細胞克隆技術從人胚大腦皮層中分離和培養出具有自我更新和多分化潛能的神經干細胞，其包括以下步驟：原代細胞的分離和培養，傳代培養及單細胞克隆、傳代，克隆誘導分化，以及間接免疫熒光檢測；其中，

所述原代細胞的分離和培養步驟包括：將胚胎在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12的細胞培養液中漂洗，用細吸管吹打瓶內組織碎塊至完全散開，制成細胞懸液，經100目不銹鋼網過濾，制成單細胞懸液；經分胎藍染色計數活細胞，加入含B27和EGF、bFGF的DMEM/F12無血清培養基，臺盼藍染色計數活細胞，調整活細胞濃度為1×10⁵/ml，將原代細胞種植于培養瓶，37℃，5％CO₂條件下靜置培養；

所述傳代培養及單細胞克隆、傳代步驟包括：將原代培養7天后的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，制成單細胞懸液，用含B₂₇和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按1×10⁴ml^-1濃度傳代接種于培養瓶，在37℃，5％CO₂條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代，方法同前；采用有限稀釋法將原代克隆細胞制成的單細胞懸液，稀釋到40ml^-1，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，并動態觀察；待長成單細胞克隆球后機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成后連續傳代，最后得到大量來自某單個細胞的亞克隆；

所述克隆誘導分化步驟包括：分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植于多個多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養基，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測；

所述間接免疫熒光檢測步驟包括：將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時后用4％多聚甲醛固定，進行Nestin抗體免疫熒光染色；分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植于預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，于7天、14天時取出，進行Nestin、NeuN、GFAP、CNP抗體的免疫熒光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標染色。