[發明專利]一種冬蟲夏草原草粉的雙重PCR鑒真方法

有效

• 申請號: 201210506713.6
• 申請日: 2012-12-03
• 公開（公告）號: CN103233062A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 程池;扎西才吉;李輝;姚粟;劉洋;白飛榮
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院;玉樹藏族自治州三江源藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥材鑒真領域，具體涉及冬蟲夏草原草粉的鑒真方法。?

背景技術

冬蟲夏草在傳統上多為煎湯或燉服，由于未打破蟲草的細胞壁，有效成分難以溶出，不利于人體吸收。為提高冬蟲夏草的利用效率，增加人體對冬蟲夏草有效成分的吸收，有效的方法是將冬蟲夏草粉碎后，制成片劑、膠囊劑、丸劑、酒劑等劑型產品后服用。以往通過形態識別，優質的原草容易為消費者接受，但經過粉碎加工以后，消費者的接受程度就大大降低。冬蟲夏草原草深加工產品品質控制已成為制約冬蟲夏草產業發展和升級的關鍵問題。?

目前，針對冬蟲夏草與其形態相似偽品的鑒別研究已有多個專利報道，2000年11月12日公開的中國專利CN?1274010A和2001年6月6日公開的中國專利CN?1298024A分別針對冬蟲夏草菌種的rDNA間區和18S?rDNA進行引物和探針設計，實現在分子水平上對冬蟲夏草菌種的道地性鑒別。2011年6月8日公開的中國專利CN?102086471A針對冬蟲夏草菌種的rDNA間區進行研究，并建立了一種既能鑒別冬蟲夏草真偽、又能明確其含量的分子鑒別技術；2011年10月26日公開的中國專利CN?102226217A則針對冬蟲夏草菌種的18S?rDNA進行引物設計，并開發出試劑盒應用于冬蟲夏草的真偽鑒別。以上鑒別方法主要應用于冬蟲夏草及其形態相似偽品的區分，而對冬蟲夏草原草粉的鑒真無顯著效果，難以在保證冬蟲夏草原草粉的品質上發揮作用。?

因此，在本領域需要有一種新的檢測方法用于冬蟲夏草原草粉的鑒真，實現對其品質的控制和管理。?

發明內容

本發明的目的是提供一種可用于冬蟲夏草原草粉鑒真的可靠方法。?

為達到上述目的，本發明根據冬蟲夏草的組成特點，設計冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因的PCR引物，進行一次單管雙重PCR反應，同時擴增冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因，實際擴增片斷分別為320bp和136bp。?

用于冬蟲夏草原草粉鑒真的引物序列如下：?

冬蟲夏草菌種特征性持家基因擴增引物：?

上游引物CICC-Oph-F1：5’-GCCAATCCCATCAACAT-3’?

下游引物CICC-Oph-R1：5’-CACCACCAACGACAAAA-3’?

冬蟲夏草寄主蝠蛾特征性持家基因擴增引物：?

上游引物CICC-Hep-F1：5’-GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’?

下游引物CICC-Hep-R1：5’-CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’?

本發明采用的技術方案如下：?

1)獲取樣品基因組DNA；?

2)采用上述引物在PCR儀上進行PCR擴增；?

PCR擴增反應體系為25μL，其中10×Taq?reaction?buffer?2.5μL，4條引物(10μmol/L)各1μL，10μmol/L的dNTP?2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O?15μL。?

PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5min，進入循環：95℃10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環，然后72℃延伸5min。?

3)PCR擴增產物用2％的瓊脂糖凝膠進行檢測。?

4)樣品的真實性判斷?

在紫外燈下查看電泳條帶，在136和320bp處有明亮條帶的為冬蟲夏草原草，僅在320bp具有明亮條帶的是冬蟲夏草菌絲體產品，在136和320bp處均無條帶為偽品。?

本發明經過充分的前期試驗篩選和優化，得到的引物特異性強，PCR擴增條件簡單，采用一次單管多重PCR反應后，通過電泳檢測便可鑒別產品真偽，操作簡單，成本低，準確度高，具有很好的應用前景。?

附圖說明

圖1和圖2分別為冬蟲夏草菌種MAT1-2-1基因及其寄主蝠蛾COI基因的特異性引物設計示意圖，其中有下劃線的部分為擴增片段對應的核苷酸序列，有下劃線的斜體部分為所設計的引物特異性結合位點。?

圖3為PCR擴增產物在2％瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，1-DL2000Marker，2-冬蟲夏草原草粉，3-冬蟲夏草菌粉，4-蝙蝠蛾擬青霉菌粉，5-蛹蟲草菌粉，6-陰性對照，7-DL2000?Marker。?

具體實施案例?

下面結合實施案例對本發明進行具體說明，實施案例是為了進一步闡述本發明，而不會給本發明造成任何限制。?