[發明專利]人羊膜間充質干細胞的分離方法

無效

• 申請號: 201210506430.1
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103789258A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 陸華
• 申請（專利權）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 何學成

技術領域

本發明涉及生物技術領域的一種培養人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)的方法，特別涉及一種采用酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)來培養人羊膜間充質干細胞的過程中的人羊膜間充質干細胞的分離方法。

背景技術

正常人羊膜組織結構分為上皮細胞層、基底膜、致密層、纖維細胞層及海綿層，其中人羊膜間充質干細胞(human?amnion?membranemesenchymal?stem?cells，hAMSCs)位于羊膜的最內層，是在受精后第8天從外胚葉發育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性，擁有更大的多向分化潛能，hAMSCs理論上可以分化成各種組織細胞，同時因羊膜獲得方便且回避了倫理學爭議，有潛力成為未來臨床應用的干細胞來源之一。hAMSCs原代培養分為組織塊培養和酶消化法培養，組織塊培養由于不是每個組織塊都能培養成功，且容易混雜有成纖維細胞污染，培養形成單層的時間較長，不利于快速大量獲取細胞，難以滿足干細胞研究的需要；酶消化法鑒于羊膜組織結構致密，結構致密，用酶一次消化時間過長對細胞損傷較大，時間太短得到的細胞數量太少。因此有必要建立一種在體外分離、純化并大量擴增和誘導分化hAMSCs的方法。

發明內容

為建立一種在體外分離、純化并大量擴增和誘導分化hAMSCs的方法，本發明提供一種采用酶消化法聯合表皮生長因子(EGF)培養人羊膜間充質干細胞的方法，通過采用胰蛋白酶和膠原酶分步多次消化來收集羊膜細胞，此時的羊膜細胞是上皮細胞、間質干細胞、成纖維細胞等多種細胞的混合物，加入表皮生長因子(EGF)，將貼壁培養和消化時間控制相結合，可獲得純度和活性較高人羊膜間充質干細胞。

具體的，本發明的酶消化法聯合EGF培養人羊膜間充質干細胞的方法包括如下步驟：hAMSCs的分離，hAMSCs的原代培養，hAMSCs的傳代培養與擴增，hAMSCs的凍存和復蘇，以及hAMSCs細胞免疫表型的檢測。

其中，所述hAMSCs的分離步驟包括：無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，采用機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hanks液沖洗數次以清除殘留血跡，將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1mm³碎塊，加入胰蛋白酶37℃消化10分鐘；加入含小牛血清的DMEM終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾；過濾后的羊膜組織中加入II型膠原酶消化液，37℃消化30分鐘；加入含小牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞；1000轉/分鐘離心5分鐘；臺盼蘭染色計數活細胞，調整細胞密度為1×10⁶/ml，接種至培養瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培養基；置37℃、飽和濕度、體積分數5％的CO₂培養箱內培養，倒置相差顯微鏡下每日觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液1次，并攝片記錄；待細胞匯合度達80％后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液于37℃消化2-3分鐘，加入培養基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮后，以1×10⁷/ml的細胞密度傳代；傳代過程中，隔日換液1次，待細胞長滿70％瓶底重復以上步驟。

所述hAMSCs的原代培養步驟包括：將羊膜細胞懸液移入離心管，配平，2000rpm離心15分鐘，棄上清，收集細胞；將收集的細胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘進行15分鐘洗滌，收集細胞；接種細胞前吸取FBS加入細胞培養瓶，置37℃，5％CO₂，飽和濕度培養箱孵育30分鐘，對培養瓶進行包被；棄包被液，用含20％FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數細胞；調整細胞濃度為1.0×10⁶細胞/ml，接種于包被后的細胞培養瓶中，置于37℃，5％CO²，飽和濕度的細胞培養箱中培養，相差顯微鏡動態觀察；培養4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次。觀察細胞貼壁生長至80-90％匯合時，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得細胞為原代細胞。