[發明專利]密度梯度離心法分離培養人骨髓間充質干細胞的方法

無效

• 申請號: 201210505426.3
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103013912A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 陸華
• 申請（專利權）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 何學成

1.一種密度梯度離心法分離培養人骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，其包括如下步驟：BMSCs的分離，BMSCs的原代培養，BMSCs的傳代培養與擴增，培養細胞表面抗原檢測以及生長曲線的測定；其中，

所述BMSCs的分離步驟包括：骨髓收集并在無菌條件下進行肝素抗凝收集的骨髓懸液，D-Hanks液稀釋，在離心管加入Ficoll分離液，稀釋后的骨髓懸液緩慢加在Ficoll分離液上，1800轉/分鐘離心15分鐘，收集富含有核細胞的界面層細胞，D-Hanks液清洗，調整細胞濃度為1×10⁵/ml，接種于的培養瓶，在37℃、5％CO₂、飽和濕度靜置培養；

所述BMSCs的原代培養步驟包括：培養72小時后全量換液，之后每2天換一次液；細胞生長達到70％融合后，吸出培養基，D-Hanks液洗一遍培養瓶；然后用0.25％的胰蛋白酶消化3-5分鐘，待細胞回縮折光性增強以致有細胞浮起時加入含血清培養基終止，移液管反復吹打培養瓶底，吸出懸液后離心收集細胞；懸浮細胞在換液時被去除；

所述BMSCs的傳代培養與擴增步驟包括：調整細胞濃度，以1∶3的比例傳代培養，之后每2天換液一次，直至再次傳代；

所述培養細胞表面抗原檢測步驟包括：取培養第2或第3代細胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS調整細胞濃度至1×10⁷/ml，然后加入鼠抗人單克隆抗體，置4℃孵育半小時，PBS清洗后進行流式細胞儀檢測分析；以及

所述生長曲線的測定步驟包括：分別取生長狀態良好的原代、第3代、第15代培養細胞制備成單細胞懸液，按1×104/ml接種于24孔板，每孔加入1ml培養基，以后每天隨機取3個孔，消化后計數，計算平均值，持續計數8天，繪制出各代培養細胞的生長曲線。

2.如權利要求1所述的密度梯度離心法分離培養人骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，所述BMSCs的分離步驟中培養瓶中的培養基為DMEM-LG+1％Penicillin-Streptomycin+5ng/ml?bFGF+10％FBS。

3.如權利要求2所述的密度梯度離心法分離培養人骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，所述DMEM-LG的pH值為7.2，所述FBS胎牛血清終濃度為100mL/L-150mL/L。

4.如權利要求1所述的密度梯度離心法分離培養人骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，所述BMSCs的原代培養步驟中在用胰蛋白酶消化傳代時，先用PBS洗滌除去殘留的血清；胰蛋白酶的濃度為2.5mL/L，消化時間為3-5分鐘。