[發(fā)明專利]人胚中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞體外定向分化為多巴胺能神經(jīng)元方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210505420.6
• 申請日: 2012-12-02
• 公開（公告）號: CN103045538A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐杰;房文峰;朱愛華
• 申請（專利權(quán)）人: 吳衛(wèi)江
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797
• 代理公司: 常州市維益專利事務(wù)所 32211
• 代理人: 何學(xué)成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞體外定向分化為多巴胺能神經(jīng)元方法。?

背景技術(shù)

神經(jīng)干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景,細(xì)胞替代治療可以治療帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神經(jīng)退行性疾病以及腦卒中、腦外傷等引起的神經(jīng)功能缺失,神經(jīng)干細(xì)胞作為基因治療的載體,可以治療帕金森氏病、粘多糖病和顱內(nèi)腫瘤等。但是,神經(jīng)干細(xì)胞的研究目前尚處于初期階段,有許多問題還沒有得到解決,如神經(jīng)干細(xì)胞如何在體內(nèi)和體外定向分化為我們需要的某種特定的神經(jīng)細(xì)胞,體外分離得到的神經(jīng)干細(xì)胞與體內(nèi)的是否有差異等等,這些都需要進(jìn)一步的研究。?

神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究是近十年來神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一,近年來不斷有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人胚腦和其它哺乳類動物一樣存在具有自我更新和廣泛分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞,如何在體外通過安全有效的方法將干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，并盡可能提高其分化比例，將為干細(xì)胞最終應(yīng)用于臨床治療帕金斯氏病提供有力的理論支持。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明將取自胚齡10-13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎中分離出中腦組織，培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞,然后將兩種安全的誘導(dǎo)分化方法進(jìn)行組合，依次對干細(xì)胞進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元方向的分化，并用免疫組化方法予以鑒定，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后明確該體外誘導(dǎo)分化方法的效率。?

具體的方法步驟包括：?

S1：原代細(xì)胞的分離培養(yǎng):取胚齡10-13周水囊引產(chǎn)的新鮮人胚胎，無菌條件在顯微鏡下分離出胚胎中腦組織，剝離腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血細(xì)胞,用細(xì)吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開,離心洗滌后吹打制成懸液,經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾,制成單細(xì)胞懸液,加入含B27（1:50）（GibcoBRL）和EGF(Serotec)20ng/mL、bFGF-2(Chemicon)20ng/mL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞,調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×10⁵/mL,將原代細(xì)胞種植于25平方厘米培養(yǎng)瓶中(8mL細(xì)胞懸液/瓶),37℃,5%CO₂條件下靜置培養(yǎng)；?

S2：神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng):原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用0.25%胰酶37℃消化15-30min(也可機(jī)械切割分離或吹打)，制成單細(xì)胞懸液，用含B27和EGF、bFGF的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液按1×10⁶/mL濃度傳代接種于培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO₂條件下靜置培養(yǎng)，直至次代克隆球產(chǎn)生，平均5-7天傳代一次；?

S3：含抗壞血酸培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化:將不同代數(shù)的神經(jīng)球體外培養(yǎng)七天后種植入含不同濃度抗壞血酸培養(yǎng)基（DMEM/F12+B27+AA）的培養(yǎng)皿中；?

S4：正常成人腦脊液分化培養(yǎng):在以上含抗壞血酸培養(yǎng)液分化培養(yǎng)后3天，向培養(yǎng)基中加入正常成人腦脊液，比例為DMEM/F12+B27+30%腦脊液，觀察其生長分化情況，在培養(yǎng)10天后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；?

S5：免疫細(xì)胞化學(xué)染色:將含有分化細(xì)胞的培養(yǎng)板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗，每次5分鐘，0.25%TritonX-100處理15min（破膜），PBS洗三次，每次5min，羊血清封閉15min，加入兔抗人TH抗體（一抗）37℃處理1小時，PBS沖洗三次，每次5min，后加入生物素結(jié)合的羊抗兔IgG(二抗)37℃孵育45min，PBS洗三次，每次5min，滴加SABC后室溫下處理20min，PBS洗三次，每次5min，新鮮配制的DAB顯色劑顯色15min，PBS洗三次，每次5min，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察；?

S6：細(xì)胞計(jì)數(shù)：免疫細(xì)胞化學(xué)染色TH（+）的細(xì)胞代表多巴胺能神經(jīng)元，蘇木精復(fù)染，藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)代表總細(xì)胞數(shù)。倒置顯微鏡下（20×）對分化的細(xì)胞隨機(jī)選擇六個獨(dú)立視野計(jì)數(shù)TH（+）細(xì)胞，及總細(xì)胞數(shù)；每次至少做四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。殘留在神經(jīng)球中的神經(jīng)干細(xì)胞因聚合密集，難以計(jì)數(shù)，排除在外；?

本發(fā)明的體外將神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，先將無血清培養(yǎng)條件下的神經(jīng)干細(xì)胞植入特定濃度的抗壞血酸培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，然后加入一定濃度的正常成人腦脊液，利用腦脊液中現(xiàn)存的各種誘導(dǎo)因子進(jìn)一步加速干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。該方法較前所報道的各種其他誘導(dǎo)方法明顯提高多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)成功比例。?

附圖說明

通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中：?