[發明專利]人胚皮層神經干細胞的原代細胞的分離及傳代培養方法

無效

• 申請號: 201210505244.6
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103789269A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 陸華
• 申請（專利權）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/0793;C12N5/079
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 何學成

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種神經干細胞的原代細胞的分離培養、單細胞克隆以及傳代培養方法，其應用于神經干細胞的細胞株的克隆培養過程。

背景技術

神經干細胞的發現是神經科學領域的重大突破，為神經發育和神經組織移植等研究領域開辟了廣闊前景。神經干細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處于分化的非終末狀態，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產生中樞神經系統的三種主要細胞，即神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。一般認為神經干細胞主要存在于哺乳動物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區等，成年哺乳動物腦的側腦室壁和海馬等區。有關哺乳動物胚胎階段和成年動物在特定腦區存在神經干細胞已不斷得到證實，但對人類神經干細胞的研究尚少。

發明內容

為獲得大量、穩定的神經干細胞，本發明提出一種神經干細胞單細胞克隆及傳代培養方法，利用無血清培養和單細胞克隆技術在人胚皮層中分離具有單細胞克隆能力的細胞，并進行培養、傳代，貼壁分化觀察，采用間接免疫熒光檢測克隆細胞的神經巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特異性成熟神經細胞抗原的表達予以鑒定。

具體的，為實現本發明的目的，所述的神經干細胞的原代細胞的分離及傳代培養方法包括以下步驟：原代細胞的分離和培養，傳代培養及單細胞克隆、傳代，克隆誘導分化以及間接免疫熒光檢測；其中，

所述原代細胞的分離和培養步驟具體為：取胚齡12周水囊引產的新鮮人胚胎，在無菌條件下分離出胎腦大腦皮層，剝離硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1∶1)的細胞培養液中漂洗三次，用細吸管反復吹打瓶內組織碎塊至完全散開，制成細胞懸液，經100目不銹鋼網過濾，制成單細胞懸液，經分胎藍染色計數活細胞加入含B₂₇和bFGF的DMEM/F12無血清培養液，調整細胞含量為1×10⁵ml^-1，將細胞懸液分裝于25ml細胞培養瓶，每瓶3ml，37℃，5％CO₂條件下靜置培養7天；

所述傳代培養及單細胞克隆、傳代的步驟具體為：將原代培養7天后的細胞克隆懸液用吸管輕柔吹打進行機械分離，制成單細胞懸液，用含B₂₇和bFGF的無血清培養液將細胞懸液按1×10⁴ml^-1濃度傳代接種于培養瓶，在37℃，5％CO₂條件下靜置培養7天，同時進行克隆形成實驗，計數每代的克隆形成率，每7-9天機械分離傳代；然后采用有限稀釋法將原代克隆細胞制成的單細胞懸液，稀釋到40ml^-1，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，選取僅有一個細胞的培養孔作記號，并動態觀察；待長成單細胞克隆球后機械分離成單細胞懸液，再將一個克隆的所有細胞種至培養瓶中，待次代克隆長成后連續傳代，最后得到多個來自某單個細胞的亞克隆；

所述克隆誘導分化的步驟具體為：分別選取部分傳代及單細胞克隆的細胞種植于多個多聚賴氨酸包被的玻片上，并加入含血清培養基，觀察其生長分化情況，分別于7天、14天行免疫熒光檢測；

所述間接免疫熒光檢測的步驟具體為：將克隆細胞滴至多聚賴氨酸包被的玻片上，貼壁12小時后用4％多聚甲醛固定，進行神經巢蛋白n抗體免疫熒光染色；分別將傳代及單細胞克隆的細胞種植于預置多聚賴氨酸包被玻片的含血清培養集中，于7天、14天時取出，進行Nestin、NeuN、GFAP、CNP抗體的免疫熒光單標染色及NeuN和CNP抗體的免疫熒光雙標染色。

本發明采用無血清培養和單細胞克隆技術從從胚齡12周的新鮮人胚皮層中成功建立一株人胚神經干細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原。分化后的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。

附圖說明

通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中：

圖1所示為本發明的神經干細胞單細胞克隆細胞株的分離培養方法的步驟流程圖。

具體實施方式

如圖1所示的本發明的神經干細胞原代細胞的分離及傳代培養方法的步驟流程圖，其應用于神經干細胞單細胞克隆細胞株的分離培養過程，所述方法包括以下步驟：