[發(fā)明專利]貼壁密度梯度法聯(lián)合EGF培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210505243.1
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103013911A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸華
• 申請（專利權(quán)）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 常州市維益專利事務(wù)所 32211
• 代理人: 何學(xué)成

1.一種貼壁密度梯度法聯(lián)合EGF培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：UC-MSCs的分離，UC-MSCs的原代培養(yǎng)，UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，UC-MSCs的凍存和復(fù)蘇，以及UC-MSCs細(xì)胞免疫表型的檢測；其中，

所述UC-MSCs的分離步驟包括：無菌條件下，將胎兒臍帶浸入PBS中，4℃保存；在超凈臺內(nèi)從培養(yǎng)基中取出臍帶，用含有雙抗和兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗臍帶沖去殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質(zhì)組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成1mm³大小的組織塊，將組織塊移至內(nèi)含一磁力攪拌子的玻璃瓶中，加入膠原酶，37℃下持續(xù)磁力攪拌下消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為0.125％的胰酶，在37℃環(huán)境中繼續(xù)磁力攪拌消化30分鐘后，加入10％體積的胎牛血清終止消化；消化產(chǎn)物先后經(jīng)100目及200目的細(xì)胞篩過濾，去除未消化的組織，收集濾液；

所述UC-MSCs的原代培養(yǎng)步驟包括：將臍帶細(xì)胞懸液移入離心管，配平，2000rpm離心15分鐘，棄上清，收集細(xì)胞；將收集的細(xì)胞用PBS吹打成均勻懸液，1500rpm旋轉(zhuǎn)15分鐘洗滌，收集細(xì)胞；接種細(xì)胞前吸取FBS加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃，5％CO₂，飽和濕度培養(yǎng)箱孵育30分鐘，對培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被；棄包被液，用含20％FBS，4ng/mlEGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細(xì)胞，吹打均勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁶細(xì)胞/ml，接種于包被后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO²，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3-4天半量換液一次；觀察細(xì)胞貼壁生長至80-90％匯合時(shí)，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞；

所述UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增步驟包括：觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長至80-90％匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，吸取PBS緩沖液加入培養(yǎng)瓶內(nèi)洗滌，棄去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細(xì)胞，按1∶2-1∶3比例傳代培養(yǎng)；置37℃，5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計(jì)為第1代UC-MSC；待細(xì)胞生長至80-90％匯合時(shí)，重復(fù)上述操作進(jìn)行多代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增；以及

所述UC-MSCs細(xì)胞免疫表型的檢測步驟包括：取培養(yǎng)第2或第3代細(xì)胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷/ml；分別加入鼠抗人單克隆抗體，置4℃孵育半小時(shí)，PBS洗1次，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析。

2.如權(quán)利要求1所述的貼壁密度梯度法聯(lián)合EGF培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增步驟中，培養(yǎng)體系為20％FBS，4ng/ml?EGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。

3.如權(quán)利要求1所述的貼壁密度梯度法聯(lián)合EGF培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述UC-MSCs的凍存和復(fù)蘇步驟中的凍存步驟包括：取出所需試劑，配制凍存液，每個(gè)凍存管中加入人AB血清350ul和DMSO150ul，置于冰上預(yù)冷；取出需要凍存的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗兩次后，吸棄洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆蓋瓶底，放入37℃孵箱中2-3分鐘；在倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈圓形飄起時(shí)，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，用微量加樣槍吸出少許用做細(xì)胞計(jì)數(shù)；將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，離心結(jié)束，吸棄上清；向離心管中加入人AB血清，充分混勻，待用；將上述臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞懸液加入到凍存管中，封蓋，震蕩，充分混勻，放置在4℃冰箱30分鐘后迅速移入到-80℃，24小時(shí)后，移入液氮中，進(jìn)行長期保存。

4.如權(quán)利要求1所述的貼壁密度梯度法聯(lián)合EGF培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述UC-MSCs的凍存和復(fù)蘇步驟中的復(fù)蘇步驟包括：取出所需試劑，平衡至室溫，準(zhǔn)備37℃水浴備用；從液氮中迅速取出需要復(fù)蘇的凍存管，立即于37℃水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭凍存管蓋周圍，旋開管蓋；在超凈臺內(nèi)將凍存管內(nèi)的細(xì)胞移入到無菌離心管內(nèi)，緩慢逐滴加入DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕混勻；，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后接種，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加新的完全培養(yǎng)液；置5％CO2，飽和濕度，37℃培養(yǎng)箱重新培養(yǎng)。