[發明專利]利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法

無效

• 申請號: 201210504848.9
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN102994551A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 徐家萍;李昕琦;杜暢;王文兵;高娟;王成林
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。?

背景技術

抗菌肽(antimicrobial?peptides，AMPs)是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。隨著生物科技不斷發展，抗菌肽作為新型抗生素及新型藥物，在農業、醫藥、食品等領域發揮著重要作用。至今為止，已從自然生物中分離得到上千種抗菌肽，其中cecropins類抗菌肽是目前研究最清楚、效果最顯著的抗菌肽，已發現有A、B、C、D、E五種結構，這類抗菌肽還具有耐酸，耐熱，耐堿以及不易產生耐藥性等特點，在微生物，動植物方面有廣泛應用。?

近年來，Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統得到廣泛應用，該系統根據F因子載體的原理，改變了傳統的昆蟲重組桿狀病毒的構建方法，構建一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid，該系統具有以下優勢：（1）重組率有顯著提高，幾乎可達100%（2）通過藍白斑篩選重組病毒有篩選優勢，不會產生野生型和非重組型病毒污染的問題，也不再需要傳統繁瑣的空斑篩選分析來純化重組病毒（3）大大地縮短了重組病毒構建所需要的時間，可以由原來的4-6周或更長減少到僅7-10天。?因此，該技術可以快速、同時產生多種重組病毒。這是一種最快速簡捷地生產重組病毒的方法。?

隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品和環境質量的要求越來越高，人們對抗生素的副作用認識日益加深，而抗菌肽具廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環保型制劑。可應用生物工程的技術方法生產抗病菌的轉基因動植物產品，同時可以通過基因工程的技術方法大量的表達抗菌肽，使之成為新一代肽類抗菌藥的來源，具有出廣闊的應用前景。?

利用家蠶桿狀病毒作為表達載體時，應用最多的是將外源目的基因替代polh基因，利用Pph帶動目的基因高效表達。產生的重組病毒由于沒有多角體蛋白外殼的保護，只能通過皮下注射的方式接種家蠶，導致效率低下，因此可利用雙啟動子表達載體構建可同時表達polh基因和BmCecB2基因的表達載體，獲得的重組病毒，可經口接種家蠶，在家蠶體中表達抗菌肽，此方法與人工皮下注射家蠶相比，其優點省時省力，提高了生產效率，有利于規模化生產。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法。?

本發明是通過以下技術方案來實現的。?

一種利用雙啟動子表達載體在家蠶幼蟲中表達家蠶抗菌肽CecropinB2的方法，步驟包括：?

將如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分別克隆到啟動子表達載體以構建重組雙啟動子表達載體；將重組雙啟動子表達載體轉化到DH10Bac感受態細胞中，提取質粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；Bacmid在轉染試劑脂質體介導下轉染家蠶培養細胞，獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達，獲得具有抑菌活性的抗菌肽。?

進一步地，上述雙啟動子表達載體為pFastBacDUAL。?

進一步地，上述BmCecB2基因及polh基因分別插入雙啟動子表達載體pFastBacDUAL的Pp10和Pph的MCS的下游處構建重組雙啟動子表達載體。?

進一步地，上述重組穿梭載體Bacmid是通過將mini-Tn7轉座子從雙啟動子表達載體轉位到穿梭載體Bacmid上mini-attTn7靶位點，得到Gen抗性，再通過通過涂布于含有Kan，Gen，Tet，IPTG，X-gal的LB平板上進行藍白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養，堿裂解法提取獲得的。?

進一步地，上述在轉染試劑脂質體介導是指重組Bacmid及脂質體，分別加入無血清的Bm細胞培養基,將兩種溶液混勻，室溫靜置,另取生長良好的Bm細胞，加入無血清的Bm細胞培養基及重組Bacmid/脂質體復合物，培養一段時間，吸掉上清，加入含有10%血清的Bm細胞培養基，繼續培養，觀察。?

進一步地，上述定量的重組病毒多角體的濃度為2×10⁷NPB/ml。?

進一步地，上述重組病毒多角體的添食量為每頭蠶7μl。?

本發明的有益效果：?