[發明專利]一種蜂花粉核酸的提取方法

無效

• 申請號: 201210502532.6
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103146682A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 高林;胡延萍;王莉;李瑞欣;李毅
• 申請（專利權）人: 青海睿元藥物研究所有限責任公司;中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 西寧工道知識產權代理事務所 63102
• 代理人: 全宏毅

一、技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種蜂花粉核酸的提取方法。

二、背景技術

蜂花粉是蜜蜂采集蜜源植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液形成的不規則扁圓形團狀物。蜂花粉的營養成分十分豐富，不僅含有豐富的蛋白質、糖類、脂類、維生素、有機酸、礦物質、核酸，還有酶和其他生物活性物質，且具有低脂肪、高蛋白的特點，常被稱為“微型營養庫”和“完全營養素”，是21世紀新型的營養源和保健食品。

蜂花粉中核酸含量豐富，蔣瀅等人的檢測發現，100g油菜花粉中含有386.72mg核酸，且核酸具有獨特的抗衰老作用。目前國內外學者認為多吃含核酸的食物可使細胞再生，預防衰老和各種慢性疾病的發生，?美國、日本和我國已用核酸產品對免疫功能低下者和腫瘤病人進行治療。補充核酸，DNA和RNA能刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖及分泌速度，從而提高機體免疫功能。

蜂花粉核酸的提取是核酸功能發揮和產業化的關鍵。目前，植物中核酸的提取主要采用CTAB法、SDS法、苯酚法、三氯乙酸（TCA）或高氯酸法，其中CTAB法提取核酸純度高而得到廣泛應用，該方法中需添加Tris-HCl，Tris為實驗室有毒物質，對人體有害，又不易揮發去除，因而該方法提取的核酸不能用于食品及藥品，對核酸的廣泛應用受到限制，且提取成本高。

三、發明內容

本發明的目的是提供一種處理成本低，操作簡單，快速且無有毒有害物質殘留的蜂花粉核酸提取技術。本發明擬采取的技術方案為：一種蜂花粉核酸的提取方法，其特征在于該方法包括以下工藝步驟：?

（1）蜂花粉壁破碎處理：蜂花粉中加入溶劑，其質量體積比為1:3~5，溶劑為提取液和體積比為23～25:1的氯仿/異戊醇混合液按等體積比混合，提取液為20?mmol/LEDTA、質量體積比為2%CTAB，1.4?mol/L?NaCl混合而成，在0～25℃溫度下浸泡12～24h后，在勻漿機中進行勻質破壁，勻漿機轉速為18000～24?000轉/min，勻質2~3次，每次5~8min；

（2）水浴：在步驟（1）獲得的勻質液中，再加入5~10倍的提取液，于55～70℃條件下水浴0.5～1.5h；

（3）提取：冷卻至室溫，再加入等體積的體積比為23～25:1的氯仿/異戊醇，振蕩8~10min，在0~4℃、4000～12000r/min、離心管條件下離心分離8~10min，得提取液；

（4）重復提取：將步驟（3）所得固相重復步驟（3）2～4次；

（5）純化：合并步驟（3）和步驟（4）獲得的提取液，在合并提取液中加入其體積2/3的0~4℃的異丙醇，混勻后在-20℃放置2h以上，棄去液相，沉淀物用體積比為75%的乙醇洗滌2～3次，去除乙醇，自然風干，得蜂花粉核酸。

本發明與現有技術相比具有以下優點：本發明提取原料易得，因此處理成本低；工藝簡單，并且在提取液配制中不添加Tris-HCl，因此，有效避免了Tris等有毒有害物質的殘留；經檢測，本發明所得蜂花粉核酸純度高，本發明得到的蜂花粉核酸可應用于食品及藥品，對蜂花粉核酸的廣泛應用開辟了新途徑。

本發明核酸提取物的檢測方法如下：

⑴核酸稀釋液配制：

取本發明所提取的油菜蜂花粉核酸，用滅菌ddH₂O按質量體積比1:50~120稀釋后，即得核酸稀釋液。

⑵微量分光光度計檢測：

取2μl上述⑴配制的核酸稀釋液，用Thermo?Scientific?NanoDrop?2000C微量分光光度計檢測其純度和含量，發現在260nm及280nm吸光度（A）的比值（A260/A280），A260/A280=1.82~2.00之間（比值A260/A280可作為核酸純度的指標，A260/A280=1.80~2.00之間，意指高純度的核酸），說明所得核酸純度較高。

根據所提花粉重量和所得核酸干重，計算其得率為0.37%，即提取100g花粉所得核酸干重為370mg。

⑶瓊脂糖凝膠電泳檢測：

取4μl上述⑴配制的核酸稀釋液，在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，UVP凝膠成像系統觀察電泳檢測結果，說明本發明能夠從油菜蜂花粉中提取得到核酸。

四、附圖說明

圖1為本發明從花粉中所提核酸電泳檢測圖