[發明專利]一種乳糖酶及其重組表達工程菌

無效

• 申請號: 201210499553.7
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103031289A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 王華明;張慧丹;黃亦鈞;劉士成;許麗紅
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N1/15;C12R1/885;C12R1/69
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種乳糖酶及其重組表達工程菌。

背景技術

β-半乳糖苷酶（β-D半乳糖苷水解酶，β-D-galactosido-galatohydrolase，EC3.2.1.23）通常被稱為乳糖酶（Lactase）。這種酶能將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的轉移作用（張樹政等，酶制劑工業，科學出版社，1984，p818-819）。乳糖酶存在于植物（尤其在杏、桃、蘋果）、細菌（乳酸菌、大腸桿菌等）、真菌（米曲霉、黑曲霉、琉球曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母）以及放線菌（天藍鏈霉菌）、動物腸道（特別是嬰兒）中。

乳糖酶主要用來治療乳糖不耐受癥、處理加工牛乳、乳清等，生產低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及減少環境污染等；例如：

1）解決乳糖不耐受癥患者食用乳制品問題。由于乳糖不耐受癥患者體內缺乏乳糖酶，他們就不能充分利用乳制品中的乳糖所提供的能量，乳糖在體內不能被吸收，就成為腸道微生物菌系的能源，導致乳酸和二氧化碳的形成，它們對腸道有刺激作用，并造成機體脫水進入結腸，最終導致腹瀉，同時發生腸梗塞和脹氣等。可通過口服乳糖酶或將乳糖酶直接加到乳制品中來解決這一問題在工業生產中可將乳糖酶加到乳制品中制成低乳糖的乳制品，一方面減輕乳糖的不耐受癥的影響，另一方面可提高乳制品的營養。

2）改良濃縮乳和濃縮乳清的質量，由于乳糖的溶解度低，在低溫下極易從濃縮乳和濃縮乳清中結晶析出，加入乳糖酶可防止冷凍乳及濃縮乳清中的乳糖結晶而引起乳酪蛋白的凝固。

3）改良冰激凌的品質。在冰激凌混合物中，如有12%以上的脫脂乳固形物時，貯藏及銷售中會產生乳糖結晶，降低了商品價值，如脫脂固形物為16%，用酶分解其50%的乳糖后，在冰箱中放置4個月仍然穩定，同時增加了甜味，減少了砂糖的用量。

近年來，利用乳糖酶生產低聚半乳糖也受到重視，因此，乳糖酶在食品工業生產中的作用日益顯著。但目前乳糖酶并未在食品工業中得到廣泛的應用，主要原因是：目前乳糖酶的產量較低，銷售價格過高，添加成本昂貴，市場上銷售的乳糖酶主要來源于酵母，此種酶耐熱性差，適用范圍窄，不能滿足食品工業多方面的需要，隨著基因工程技術的發展，尋找研制出成本低，產量高，熱穩定性強，更適合食品工業生產的乳糖酶已成為研究熱點。

目前乳糖酶基因的高效表達主要集中在來源于曲霉的乳糖酶基因上，因為曲霉的乳糖酶熱穩定性好，pH低，更適合食品加工的需要。絲狀真菌在發酵工業上長期以來一直用于抗生素、酶類和有機酸的生產，尤其在工業用酶生產中確立了核心地位。工業用酶的國際市場每年大約數十億美元，而且不斷增長，其中近40%的酶類生產來自絲狀真菌。其中瑞氏木酶表達系統具有強大的分泌異源蛋白的能力，某些瑞氏木酶菌株分泌的胞外總蛋白可達40g/L

這種高效生產和分泌蛋白的能力是細菌無法相比的，同時還能進行各種翻譯后加工，如糖基化修飾、蛋白酶切割和二硫鍵的形成等。另外與哺乳動物細胞、昆蟲等高等生物表達系統相比，木霉培養簡便，成本低，而且生長迅速，容易大規模開發形成產業化，而且產物可分泌到培養基中，不需要破壁提取產物，分離純化等下游加工過程簡單。

綜上所述，雖然針對乳糖酶基因的表達做了許多研究，但總體說來表達水平還較低，如何提高乳糖酶的表達水平將是研究的難點。

發明內容

本發明的目的是提供一種乳糖酶及其重組表達工程菌株。本發明通過將乳糖酶基因轉入里氏木霉（Trichoderma?reesei）中，構建里氏木霉工程菌株。所述工程菌株能高效表達乳糖酶,進而用于水解牛乳中的乳糖,對于工業化生產低乳糖牛乳具有潛在的應用價值。

本發明一方面提供一種乳糖酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1，其基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。

本發明一方面涉及一種里氏木霉工程菌，該工程菌攜帶有表達乳糖酶基因的表達載體。

所述里氏木霉工程菌ZHD-1（Trichoderma?reesei?ZHD-1），已于2012年11月27日保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏號為CCTCC?NO:?M2012482。

本發明所述里氏木霉工程菌株能高效表達米曲霉的乳糖酶，酶活達到251U/mL。所述乳糖酶最適作用pH為5.0，最適作用溫度為50℃，能高效水解牛乳中的乳糖，水解率高達70%，對于工業化生產低乳糖牛乳具有潛在的應用價值。

附圖說明

圖1：本發明構建的重組表達載體質粒圖譜；