[發明專利]一種靶向人核仁蛋白hRrp15 esiRNA的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201210499532.5
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103060316A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 朱長軍;姜偉;董智雄
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種制備人核仁蛋白hRrp15?esiRNA的特異性引物，其特征在于它具有

上游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGGTCATCCTCTGATAGTTGGGG

下游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGAATCATATCTTCCAGATTACC。

2.一種采用權利要求1所述的特異性引物制備人核仁蛋白hRrp15?esiRNA的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）設計PCR引物：

將hRrp15基因序列與人類基因組序列進行比對，并找到hRrp15基因的3'UTR序列，在3'UTR區域設計一段5’端含有T7啟動子序列的PCR引物：

上游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGGTCATCCTCTGATAGTTGGGG

下游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGAATCATATCTTCCAGATTACC；

（2）T7-hRrp15?3'UTR?dsDNA的制備：

以293T?細胞基因組為模板PCR擴增，50μl反應體系：

基因組DNA（0.5μg/μl）：0.5μl

10×PCR?buffer：5μl

each?2mM?dNTPs：5μl

25mM?MgCl₂：3μl

10μM上游引物：3μl

10μM下游引物：3μl

高壓去離子水：29.5μl

Taq?DNA聚合酶（5U/μl）：1μl，見圖10；

（3）T7-hRrp15?3'UTR?dsDNA的純化：

瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化T7-hRrp15?3'UTR?dsDNA，得到純化的體外轉錄模板，將純化的片段溶于40μl高壓去離子水里，并進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證得到純化產物；

（4）T7-hRrp15?3'UTR?dsRNA的制備：

純化的T7-hRrp15?3'UTR?dsDNA體外轉錄，50μl轉錄體系：

100ng/μl?T7-hRrp15?3'UTR?dsDNA：20μl

10×buffer：5μl

0.1M?NTPs：4μl

50U/μl?T7?RNA聚合酶：1μl

0.1M?DTT：1μl

DEPC水：29μl

37℃水浴過夜，12-16h

反應結束后向轉錄產物中加入1μl?RNase-free?DNaseⅠ（1U/μl），37℃水浴作用15min，作用后75℃煮5min，取出轉錄產物放置至室溫30min，將反應后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證得到轉錄產物；

（5）LiCl沉淀法純化T7-hRrp15?3'UTR?dsRNA：

上述所得的50μl轉錄反應體系中加入150μl?LiCl（7.5M?LiCl+0.5mM?EDTA混合物），-20℃沉淀過夜，13200rpm，4℃離心20min，用槍頭輕輕吸掉上清，加入冷的75%乙醇，13200rpm，4℃離心20min洗沉淀，吸棄上清，60℃烘箱烘干沉淀，加入50μl高壓去離子水溶解沉淀，應用紫外分光光度計測得純化產物濃度約為450ng/μl；

（6）T7-hRrp15?3'UTR?esiRNA的制備：

將上述得到的純化的T7-hRrp15?3'UTR?dsRNA進行GST-RNaseⅢ?大量酶切，100μl體系：

450ng/μl?T7-hRrp15?3'UTR?dsRNA：50μl

10×buffer：10μl

1.66μg/μl?GST-RNaseⅢ：2μl

0.1M?DTT：1μl

DEPC水：37μl

37℃水浴作用3h

4%?低熔點瓊脂糖凝膠電泳鑒定T7-hRrp15?3'UTR?esiRNA；

（7）T7-hRrp15?3'UTR?esiRNA的純化：

在上述酶切反應中加入5μl?0.5M?EDTA終止酶切反應，加入500?μl?of?IPN?buffer?in?QIAquick?Nucleotide?Removal?Kit?from?QIAGEN?Inc，并將總反應體系過柱，6000rpm離心1min，將柱子收集管中的液體轉入到新離心管中，并加入等體積的異丙醇，室溫沉淀esiRNA?2h，13200rpm，4℃離心20min，棄去上清，加入冷的75%乙醇洗沉淀一次，13200rpm，4℃離心20min，吸棄上清，60℃烘箱烘干沉淀，加入50μl高壓去離子水溶解沉淀，應用紫外分光光度計測得純化產物濃度約為350ng/μl。