[發明專利]一種多克隆位點的人工設計與合成方法

無效

• 申請號: 201210499204.5
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102978197A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 常玉梅;李世國;梁利群;唐然;陶然
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及多克隆位點的人工設計與合成方法，具體涉及適用于多種表達載體的多克隆位點（MCS）的合成、克隆與驗證。

背景技術

多克隆位點（Multiple?cloning?sites，MCS）是包含多個限制性內切酶酶切位點的長度為幾十個堿基的DNA序列，也稱為多位點接頭，是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS序列中，每個限制性酶切位點通常是唯一的，即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次，在不破壞質?；窘M成結構的基礎上，用一種或兩種內切酶進行酶切反應，在MCS特定的識別位點形成缺口，以此將外源基因或者序列克隆至表達載體中，對于研究和分析基因功能是必需的。MCS廣泛應用于分子克隆和亞克隆工程中，是應用分子生物學、生物工程、分子遺傳學等研究的重要實驗工具。常用的克隆載體、表達載體等質粒中均含有MCS序列。然而，由于基因結構的復雜性和多樣性，在將外源基因插入含有MCS的載體中時，MCS序列包含的酶切位點的種類有時難以滿足特定研究需求，導致特定基因功能分析無法順利進行，形成分子生物學研究領域的瓶頸。因此，迫切需要一種簡單有效的MCS序列的人工設計與合成方法，以此滿足不同的科研工作需求。

本發明的目的是人工設計并合成一段符合特定需求的MCS序列，將其克隆至表達載體驗證其有效性，以此解決大多數外源目的基因編碼序列無法插入到一些商業化載體中進行基因功能驗證的不足。

發明內容

本發明是要解決MCS序列包含的酶切位點的種類有時難以滿足特定研究需求，導致特定基因功能分析無法順利進行的難題，由此提供了一種多克隆位點的人工設計與合成方法。

本發明的一種多克隆位點的人工設計與合成方法按以下步驟實現：

一、選擇在表達載體及特定目的基因插入序列中都不存在的酶切位點；

二、將兩兩酶切位點之間以ATAT堿基結構串聯，在串聯后的堿基序列兩端各添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到序列；

三、在步驟二中的序列兩末端再隨機添加2~6個GC或AT堿基，然后送至測序公司合成，即完成了多克隆位點的人工設計與合成。

本發明有益效果：

本發明設計并合成的多克隆位點序列中的兩兩酶切位點是由ATAT結構串聯，并且在序列兩末端添加與表達載體克隆區相同的兩個酶切位點后得到滿足特定研究需求的序列，并且GC或AT序列為隨機添加，以此平衡上下游PCR擴增引物之間的退火溫度和GC含量，便于后續的PCR擴增，基因功能分析順利進行。

以表達載體Tol2及報告基因EGFP插入序列為例，兩端分別添加HinaIII和SalI酶切位點，SalI端再增加6個堿基（GGAACC）形成一段含有HindIII和SalI酶切位點，長度為115bp便于進行PCR擴增的MCS序列。合成的MCS序列中添加的ATAT結構能夠防止各不同內切酶對酶切位點的識別錯誤，同時也防止了較多GC堿基所引起的甲基化作用。GGAACC序列為隨機添加，能夠平衡上下游PCR擴增引物之間的退火溫度和GC含量，利于后續擴增。經分子生物學軟件Primer?premier5.0驗證，新引入的序列對序列酶切位點的識別沒有影響。

附圖說明

圖1是試驗1中MCS序列的人工合成結果；

圖2是試驗1中表達載體pTol2-EF1α-MCS-EGFP的構建過程；

圖3是試驗1中未注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后熒光觀察結果；

圖4是試驗1中注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后報告基因EGFP的瞬時表達熒光觀察結果；

圖5是試驗1中未注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后普通可見光觀察結果；

圖6是試驗1中注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內12h后報告基因EGFP的瞬時表達普通可見光觀察結果；

圖7是試驗1中未注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后熒光觀察結果；

圖8是試驗1中注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后報告基因EGFP的瞬時表達熒光觀察結果；

圖9是試驗1中未注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后普通可見光觀察結果；

圖10是試驗1中注射pTol2-EF1α-MCS-EGFP質粒的斑馬魚體內72h后報告基因EGFP的瞬時表達普通可見光觀察結果。