[發明專利]一種甘露聚糖酶

有效

• 申請號: 201210497040.2
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102994479A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 黃亦鈞;程斯達;康麗華;王華明;曲音波;劉國棟;陳梅
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/15;A23K1/165;C12R1/84;C12R1/885;C12R1/80
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于微生物工程生物技術領域，具體涉及一種新型的甘露聚糖酶，及用于表達該酶的重組表達工程菌。?

背景技術

甘露聚糖酶包括外切酶、內切酶和甘露糖苷酶，三種酶的協同作用才能將甘露聚糖徹底降解。其中，β-1,?4-D-甘露聚糖酶（EC?3.2.1.78）又稱為甘露聚糖酶，屬于內切酶；它能水解含有β-1,?4-D-甘露糖苷鍵，生成甘露寡糖或甘露多糖，屬于半纖維素酶類。甘露聚糖是以β-1,?4-D-吡喃甘露糖苷鍵連接的線狀多糖,?如果主鏈某些殘基被葡萄糖取代,?或半乳糖通過α-1,?6-糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分支,?則稱為異甘露聚糖,?主要有半乳糖甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖（齊軍茹等，2002，中國食品添加劑；許牡丹等，2006，動物醫學進展）。?

甘露聚糖酶在飼料、食品、造紙、石油開采及生物研究技術等多方面具有廣泛的應用前景；因此，甘露聚糖酶的研究和開發越來越多。甘露聚糖是僅次于木聚糖的第二大的半纖維素成分。飼料的主要原料如豆粕、小麥和麩皮等的細胞壁主要成分是甘露聚糖；一方面它是非淀粉多糖的抗營養因子；另一方面，低聚甘露糖具有的保健功能（陳小兵等，2005，生物工程雜志；Chesson?A,?etc.,?1987,?In?Recentt?Advance?in?Animal?Nutrition）。因此，甘露聚糖酶業已是飼料酶制劑使用量最大的單酶之一。?

產甘露聚糖酶的微生物很多，包括芽孢桿菌和絲狀真菌等。而工業化生產甘露聚糖酶的菌株主要來自誘變選育的高產菌株或高效表達的基因工程菌，如通過誘變選育芽抱桿菌AM-001的甘露聚糖酶的酶活力由36?U/ml提高到了430U/ml?耐。美國ChamGen公司選育的遲緩芽孢桿菌產甘露聚糖酶活力達到了400U/ml。但是，隨著分子生物學技術的發展，利用工程菌異源高效表達生產甘露聚糖酶是當前的主要手段。利用畢赤酵母表達生產來自Bacillus?subtilis的甘露聚糖酶其酶活達到約40000U/ml；同樣，畢赤酵母表達生產來自曲霉的甘露聚糖酶其酶活達到約343U/ml（李松瑜等，2009，生物技術通訊）。?

目前已商業化的甘露聚糖酶主要來自芽孢桿菌、木霉和青霉。芽孢桿菌所產甘露聚糖酶屬于中性甘露聚糖酶，最適pH為6.5，不耐胃酸和胃蛋白酶。木霉和青霉所產甘露聚糖酶雖具有耐酸性特點，但是不耐受胃蛋白酶。而甘露聚糖酶在單胃動物體內的作用位點決定了飼料中使用的甘露聚糖酶必須是酸性的。?

因此，為了更好的提高單胃動物對含甘露聚糖飼料的利用率，就需要獲得能夠在低pH條件下具有高活性的甘露聚糖酶。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型甘露聚糖酶及其重組表達工程菌。本發明通過將來源于斜臥青霉（Penicillum?decumbens）的甘露聚糖酶基因分別轉化入里氏木霉和畢赤酵母中，構建重組表達工程菌株。本發明的甘露聚糖酶可廣泛用作飼料添加劑，提高養殖動物的飼料利用率。?

本發明一個方面提供一種新型的甘露聚糖酶，其特征在于：?

1）其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?1的甘露聚糖酶；?

2）其氨基酸序列與SEQ?ID?NO:?1同源性高于75%的甘露聚糖酶；?

3）在1）或2）中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。?

本發明另一方面提供了編碼上述甘露聚糖酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?2。?

本發明的甘露聚糖酶，去掉信號肽后的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?3。其核苷酸的序列為SEQ?ID?NO:?4。?

本發明提供了一種表達載體，其包含上述編碼基酸序列為SEQ?ID?NO:?3的甘露聚糖酶的核苷酸。?

本發明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述去掉信號肽的甘露聚糖酶基因的表達載體。?

上述表達宿主細胞為畢赤酵母（Pichia?pastoris）。?

上述表達宿主細胞為里氏木霉（Trichoderma?reesei）。?

本發明的甘露聚糖酶用于制備飼料添加劑。?