[發明專利]一種芽孢桿菌、一種透明質酸酶及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201210497017.3
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN103255076A
• 公開（公告）日: 2013-08-21
• 發明（設計）人: 郭學平;石艷麗;李海娜;王冠鳳;薛蔚;喬莉蘋;馮寧;張曉鷗;劉愛華
• 申請（專利權）人: 華熙福瑞達生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12P19/26;A61K8/60;A61K31/728;A61P9/00;A61P17/02;A6
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 劉海羅

1.一種芽孢桿菌，其保藏號為CGMCC?No.5744，保藏日期為2012年2月8日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）。

2.一種制備透明質酸酶的方法，包括使用權利要求1所述的芽孢桿菌的步驟；具體地，包括下述步驟：

將權利要求1所述的芽孢桿菌斜面培養、種子培養、發酵培養、離心、硫酸銨分級沉淀、超濾，制得透明質酸酶。

3.根據權利要求2所述的方法，包括如下步驟：

（1）將權利要求1的芽孢桿菌進行斜面培養，得斜面菌種；

（2）取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25－40℃、100－200rpm的條件下培養10－24h，得種子液；

（3）將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25－40℃、100－300rpm的條件下培養12－24h，得透明質酸酶發酵液；

（4）離心分離發酵液，取上清液；

（5）將上清液用硫酸銨分級沉淀，過濾（例如采用0.65μm的微孔濾膜進行過濾），得到粗制的透明質酸酶；

（6）將步驟（5）得到的粗制透明質酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分子雜質，得純化的透明質酸酶。

可選地，步驟（6）也可以采用如下的步驟（6－1）至（6－3）：

（6－1）：將步驟（5）中的粗制透明質酸酶溶于pH4.5－8.0的緩沖溶液中，得粗酶液；將粗酶液裝入截留分子量為3.0×10³－1.4×10⁴Da的透析袋，放入pH4.5－8.0的緩沖溶液中，4℃下透析過夜；

（6－2）：將透析后的粗酶液進行離子交換色譜分離，色譜柱填料是DEAE瓊脂糖凝膠FF介質，用0－0.5M?NaCl溶液進行梯度洗脫，并收集洗脫峰；

（6－3）：將步驟（6－2）得到的透明質酸酶樣品進行冷凍真空干燥，得到白色粉末，即為透明質酸酶。

4.一種透明質酸酶，其通過權利要求2或3所述的方法制得。

5.一種分離的多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；具體地，所述多肽為透明質酸酶。

6.一種分離的多核苷酸，其編碼SEQ?ID?NO：2所示所示的氨基酸序列；具體地，所述多核苷酸的序列為SEQ?ID?NO：3所示的序列或SEQ?ID?NO：3的互補序列。

7.一種重組載體，其含有權利要求6所述的多核苷酸。

8.一種重組宿主細胞，其含有權利要求7所述的重組載體。

9.一種組合物，其包含權利要求4所述的透明質酸酶、權利要求5所述的多肽、權利要求6所述的多核苷酸、權利要求7所述的重組載體或者權利要求8所述的重組宿主細胞；可選地，其還包含藥學上或食品學上可接受的載體或輔料。

10.權利要求1所述的芽孢桿菌或權利要求6所述的多核苷酸或權利要求7所述的重組載體或權利要求8所述的重組宿主細胞在制備透明質酸酶中的用途。

11.權利要求4所述的透明質酸酶或權利要求5所述的多肽在制備寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽、低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽、或者低分子硫酸軟骨素中的用途；具體地，所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽，分子量為大于或等于3000Da，并且小于10⁴Da；具體地，所述低分子透明質酸或低分子透明質酸鹽，分子量為10kDa－1000kDa，優選為10kDa－500kDa。

12.寡聚透明質酸或者寡聚透明質酸鹽在制備促血管生成和/或促進創傷愈合或抗氧化或防曬或曬后修復或清除自由基或促進HUVEC細胞增殖或抗腫瘤或提高免疫力的藥物或者在制備食品或保健品或化妝品中的用途；具體地，所述化妝品為防曬、曬后修復、抗衰老、或保濕的化妝品。具體地，所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽由SEQ?IDNO：2所編碼的透明質酸酶制得或者所述寡聚透明質酸或寡聚透明質酸鹽N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖的含量≥65％、≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％或≥95％（w/w）。