[發明專利]核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立及鑒定方法

無效

• 申請號: 201210496554.6
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN103045647A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 李文哲;金錦花
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/68;C12Q1/48
• 代理公司: 大連智慧專利事務所 21215
• 代理人: 劉琦

1.一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、根據Fut8基因序列，設計1條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列：

CUGAUCACU?CCAGCAGAGA（759-778）；

并設計Fut8siRNA雙鏈短發夾結構：

siRNA-sense:

5′-GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3′;

siRNA-antisense:

5′-CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3′

S2、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINsi-hU6中，構建pSINsi-hU6-Fut8siRNA載體；

S3、Fut8基因沉默細胞模型的建立，包括如下分步：

S31、用脂質體轉染法將pSINsi-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho載體，pGP載體共同轉染293T細胞，包裝攜帶有pSINsi-hU6-Fut8siRNA的逆轉錄病毒；

S32、將3-5×10⁴靶細胞進行9-12h培養，利用7-10ug/mL?polybrane孵育后，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉染至靶細胞內；

S33、用400-1000ug/ml?G418進行篩選，并挑取單個細胞，進行擴大培養，獲得穩定的Fut8基因沉默細胞模型。

2.根據權利要求1所述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特征在于，步驟S31中的的脂質體與pSINsi-hU6-Fut8siRNA、pE-ampho載體、pGP載體的摩爾濃度比例為4-5：1.5-2：1-1.5：1-1.5。

3.根據權利要求2所述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特征在于，步驟S32中病毒液與細胞培養液之間的比例為1-2:10。

4.一種針對上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的檢測方法，其特征在于，實時定量PCR鑒定，其中，所述實時定量PCR的引物序列為，

sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG，

antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。

5.一種針對上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型酶活性的檢測方法，其特征在于，利用HPLC法測定Fut8酶活性，細胞裂解液蛋白含量為0.2-0.5mg,反應時間為2-5小時。