[發明專利]一種向微擬球藻葉綠體中導入外源DNA的方法及相關的葉綠體基因組序列

有效

• 申請號: 201210494514.8
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103834640B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 路延篤;徐健;辛一;魏力
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/79;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 周秀梅,李穎

技術領域

本發明涉及生物基因工程技術領域，具體的說是一種向微擬球藻葉綠體中導入外源DNA的方法及相關的葉綠體基因組序列。?

技術背景

能源和資源短缺已經成為制約我國經濟持續發展、影響我國國家安全的重大戰略問題。基于生物催化劑清潔、高效、可再生等特點，生物制造可以大大減少工業發展對化石資源依賴，減少能耗、物耗、水耗和廢棄物排放，顯著提高經濟效益，增強市場競爭力。與石化路線相比，生物制造可以平均節能30-50%，減少人類對環境的影響達20-60%。太陽光是地球上最充足的清潔能源。光合作用是唯一能捕捉太陽能的生物途徑,還可以固定二氧化碳，因此是實現利用太陽能與大幅減排CO₂進行清潔能源生產的有效途徑。?

微藻是最有潛力實現現實意義上的光能整合生物制造的細胞工廠之一，其優勢在于：第一、高效光能轉化生物質：微藻（包括原核藍藻和真核藻類），和綠色高等植物一樣，有比較完整的光合作用系統。微藻的理論光合作用效率最高可達10%。相比而言，陸生作物一般僅能將0.1~0.7%（C3作物）或1.5~2.5%（C4作物）的太陽能轉化為生物質。可見，微藻作為光能整合生物加工細胞工廠的優勢遠大于陸生植物。此外，一些微藻具備出色的環境耐受能力，可以在淡水、海水、生活廢水、工業廢水中生長；在通入煙道氣時強勁生長，能夠室外規模培養。第二、高效CO₂固定：微藻遍布于地球海洋、河流和湖泊等淡水和海洋水體中以及各種土壤（包括酷暑和寒冷的荒蕪環境）里，甚至人跡罕至的南北極等極端環境中。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40%以上，在能量轉化和碳元素循環中起到重要的作用。大規模微藻培養有望實現工業化方式固定太陽能和大幅度減排CO₂，提供低碳的清潔能源。第三、高效積累高能量密度、高附加值產物：微藻代謝途徑豐富，以微擬球藻為例，它不僅可以在靜止狀態下大量積累油脂（甘油三酯，即生物柴油），還可以積累微藻蛋白（藻藍蛋白、飼料蛋白、必需氨基酸）、長鏈多不飽和脂肪酸（AA、EPA、DHA）、多種色素（蝦青素、胡蘿卜素、葉黃素）等高附加值產物，可以用于開發顏料、肥料、土壤調節劑、抗氧劑、食品添加劑、化妝品。?

海洋微擬球藻（Nannochloropsis?sp.)，是一種海洋單細胞微藻，在分類學上歸屬于褐藻門(Phaeophyta)，大眼藻綱(Eustigmatophyceae)，單珠藻科（Monodopsidaceae）。微擬球藻直徑2-5μm，無組織分化，生態分布廣泛；?具有豐富的在藏藻株資源；進化地位獨特，是單細胞微藻中獨立的一個屬。有研究比較了31種微藻的生物量、脂質含量及產量，其中海洋微藻Nannochloropsis的脂質產量排在第一位（表1）。已發現許多株Nannochloropsis都具有1）生長迅速；2）在高光強或營養缺失條件下積累大量三脂酰甘油（TAG）等優點。此外，在一些大型（如美國Solix公司）和半工業規模（亞利桑那州立大學、中國科學院青島生物能源與過程研究所）室外培養中發現，當通入煙道氣時，Nannochloropsis（如Nannochloropsissalina和Nannochloropsis?oculata?OZ-1）能強勁生長，且能在生長靜止期積累大量的油脂，具備大規模工業化培養的潛力。此外，微擬球藻藻體微小，富含碳水化合物、蛋白質和多不飽和脂肪酸，已被作為優良餌料大量應用于水產養殖；微擬球藻還含有多種經濟價值較高的色素，如玉米黃素、斑蝥黃素和蝦青素等。可見，微擬球藻作為功能基因組學研究和商業化應用具有明顯的優勢。?

表1代表性藻種生物量積累、油脂含量和油脂產量?

盡管微擬球藻用于光能整合生物加工的優勢明顯，但其經濟可行性仍面臨著巨大挑戰，主要的技術瓶頸包括微藻生長密度低，且僅在環境脅迫條件下積累油脂等。其在正常生理狀態下，積累長鏈（C16和C18）和極長鏈（C20、C22、C24和C26）脂肪酸，中短鏈脂肪酸含量低，造成其生產的生物柴油濁點高、易氧化，且長鏈脂肪酸的積累對微藻中性脂合成產生抑制，這些因素都成為制約微擬球藻用于光能整合生物生產的關鍵瓶頸。?

另一方面，隨著微藻生物技術的發展，微擬球藻用于構建高效微藻反應器（生產高值蛋白、油脂、色素、抗菌肽）、開發口服型漁藥等方面具有獨特優勢。然而，微擬球藻基因工程的缺失，嚴重制約了微擬球藻作為生物反應器在實踐中的應用。?