[發明專利]一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒及其應用方法

有效

• 申請號: 201210493140.8
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102925592A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 張蓉蓉;溫國元;羅青平;邵華斌;王紅琳;楊峻;艾地云;羅玲
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

1.一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括：a)RNA裂解液、b)熒光定量反應液、c)鴨黃病毒強陽性質控品、d)陰性質控品，熒光定量反應液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R?以及熒光探針DFV-P，上游引物?DFV-F序列為:??atgaataaggtggtgaaggtaatgc?25nt；下游引物DFV-R序列為：?cagattcgtgaaagtgttgagagc?24nt；熒光探針DFV-P序列為：??catgactgttttcccatcacgtcccgg?27nt，熒光探針DFV-P?5＇端標記的是熒光報告基團FAM，3＇端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。

2.按權利要求1所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于熒光定量反應液由1×PCR?Buffer,?MgCl_2?4mM,?dNTPs?0.5mM,?M-MLV酶50U?,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各0.2μM,所述的熒光探針DFV-P?為0.2μM。

3.按權利要求1所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的鴨黃病毒強陽性質控品為高滴度的鴨黃病毒監利株，其在鴨胚上增殖，經滅活后得到，經測量ELD₅₀為10^3.7/mL。

4.按權利要求1所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的陰性質控品是采集健康的且無病原的鴨組織，按體積比1:5加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存備用。

5.權利要求1所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于包括以下步驟：

1）鴨黃病毒基因組RNA的提取：分別向200μl待檢測標本、鴨黃病毒強陽性質控品和陰性質控品中加入1mlRNA裂解液，靜置5min后，加入200μl氯仿，高速離心后吸取上清，上清中加入等體積的異丙醇，再進行冰浴并高速離心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗滌后，用20μl滅菌水溶解，所得溶液即為RNA模板；

2）分別取步驟1）得到的RNA模板加入到熒光定量反應液中，用熒光定量檢測儀進行PCR反應并實時檢測反應過程中釋放的熒光強度，PCR反應得到鴨黃病毒特異性擴增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴增目的基因序列為：atg?aataaggtgg?tgaaggtaat?gcgaccggga?cgtgatggga?aaacagtcat?ggatgtcatc?tcgcgggaag?accagagggg?aagtggacag?gttgtgactt?atgctctcaa?cactttcacg?aatctgt。

6.按權利要求5所述的一種特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于熒光定量反應液由1×PCR?Buffer,?MgCl_2?4mM,?dNTPs?0.5mM,?M-MLV酶50U?,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各0.2μM,所述的熒光探針DFV-P?為0.2μM。

7.按權利要求5或6所述的特異檢測鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于,用于熒光定量RT-PCR檢測儀進行PCR反應的反應條件為:

42℃?反轉錄20min

94℃?預變性5min

94℃變性10s?←→60℃退火、延伸?50s,?50?個循環。