[發明專利]同步檢測TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法

無效

• 申請號: 201210492173.0
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102952901A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 李凡;劉芳;陳海如;譚冠林;蘭平秀;王海寧;李曉靜;朱靜;吳德喜;蔡紅
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.同步檢測TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，同步檢測按照下面步驟進行：

（1）引物設計合成：

（a）分別設計合成檢測TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的正向引物TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下：

TBTVdF：5’-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，

TVDVdF：5’-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，

SatTBTVdF：5’-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，

TVDVaRNAdF：5’-GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，

????（b）分別設計合成檢測TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的反向引物TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下：

?????TBTVdR：5’-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，

?????TVDVdR：5’-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的R=A或G，

?????SatTBTVdR：5’-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，

TVDVaRNAdR：5’-TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’；

?（2）CTAB法提取染病植物組織或傳毒介體昆蟲的總核酸，作為RT-PCR擴增模板；

?（3）一步法RT-PCR擴增；

（4）電泳檢測；

（5）檢測結果分析：根據每對引物擴增片段大小與病毒的關系，觀察感染TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的煙草材料或傳毒介體昆蟲中檢測到的不同核酸帶，判斷發病煙草或傳毒介體昆蟲中具體感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV?病原物的種類。

2.根據權利要求1所述的同步檢測TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物組織或傳毒介體昆蟲的總核酸，步驟如下：

第一步、樣品準備

（1）感病植物組織準備：將3~5片病葉疊加在一起，稱取50~100?mg至研缽中；

（2）傳毒介體昆蟲準備：取30~50頭蚜蟲至研缽中；

第二步、加入1.2?mL的CTAB緩沖液，該緩沖液由質量百分比為2％的CTAB、2％的PVP-40以及pH?8.0的100?mM的Tris-HCl、1.4?M的?NaCl和20?mM?的EDTA組成混合液，最后根據混合溶液的體積加入0.2％巰基乙醇；

第三步、恒溫處理：充分研磨后，轉入1.5?mL的離心管中，在65℃溫浴下處理15~60?min；

第四步、離心處理：首先，將離心管放入離心機中12000~13000?r/min離心處理15?min，取750?μL上清液至另一1.5?mL的離心管，加入750?μL體積比為24∶1的氯仿：異戊醇，渦旋震蕩混勻30?s；然后，再將裝有上清液的離心管放入離心機中12000~13000?r/min離心處理10?min，接著，用微量移液器吸取600?μL上清液至又一1.5?mL的離心管中，并加入600?μL異丙醇，顛倒離心管充分混勻液體，室溫下放置10?min，最后將裝有上清液和異丙醇的離心管放入離心機中12000~13000?r/min離心處理15?min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500?μL?70%?的乙醇，并放入離心機中12000~13000?r/min離心處理10?min；?

第五步、干燥：用微量移液器吸出液體，沉淀部分在20℃~25℃條件下自然干燥10~15?min；

第六步、溶解：加入100?μL?20?mmol/L?pH?8.0的Tris-HCl并置于冰上10?min，用微量移液器吹打5~10次使沉淀部分充分溶解；

第七步、保存：核酸沉淀溶解液-20℃保存備用；或者將所獲得的總核酸以干粉狀態放入-80℃進行長期保存備用。