[發明專利]使用食品級乳酸菌生產和遞送的口服干擾素及其制備方法

無效

• 申請號: 201210491070.2
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103834678A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 劉占良
• 申請（專利權）人: 劉占良
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12R1/23;C12R1/245;C12R1/25;C12R1/225;C12R1/01
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1.一種使用食品級乳酸菌表達和遞送的，用于直接口服的干擾素，其特征在于，干擾素編碼基因序列在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與來源于乳酸菌的信號肽序列、錨定子序列連接，組成完整的表達框，分別被整合到乳酸菌的染色體，或者插入到表達質粒上。干擾素表達在乳酸菌細胞內、分泌到細胞外、或者錨定展示在乳酸菌細胞壁上。作為表達載體的乳酸菌菌株是缺失thyA基因的條件致死型突變株。攜載了干擾素表達框的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于口服使用。

2.按照權利要求1所述的干擾素，包括人干擾素(α、β、γ)、豬干擾素(α、B、γ)、牛干擾素(α、β、γ、Ω)、雞干擾素(α、β)、犬干擾素(α、β、γ)、狐干擾素(α、β、γ)、鴨α-干擾素(α、γ)、羊干擾素(α、β、γ)、魚(鯽魚、鱸魚、草魚、大西洋鮭、斑馬魚、金魚)干擾素等。

3.按照權利要求2所述的干擾索，其成熟蛋白的編碼基因按照乳酸菌的密碼子使用偏好性優化后的基因序列(人工序列)，是如下1）或2)的核苷酸序列：

1)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列：

序列1-33所示的核苷酸序列依次為：人干擾素α、人干擾素β、人干擾素γ、豬干擾素α、豬干擾素β、牛干擾素α-1、牛干擾素α-3、牛干擾素α-7、牛干擾素α-8、牛干擾素β-1、牛干擾素β-3、牛干擾素γ、牛干擾素Ω-1、雞干擾素α、雞干擾素β、犬干擾素α-6、犬干擾素β、犬干擾素γ、狐貍干擾素α、狐貍干擾素β、狐貍干擾素γ、鴨干擾素α、鴨干擾素γ、羊干擾素α、羊干擾素β、羊干擾素γ、鯽魚干擾素、鱸魚干擾素、草魚干擾素、大西洋鮭(三文魚)干擾素α-1、大西洋鮭(三文魚)干擾素α-2、斑馬魚干擾素、金魚干擾素；

2)與序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列。

4.按照權利要求1所述的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus?acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus?casei)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus?crispatus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus?delbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus?fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus?gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus?helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus?paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus?reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus?rhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)，以及乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)等。

5.按照權利要求1所述的完整表達框，其特征在于包括組成型或誘導型啟動子序列、來源于乳酸菌的信號肽序列、干擾素編碼基因序列、錨定子序列，以及它們之間的連接片斷組成。表達框位于表達載體乳酸菌的染色體或者質粒上。

6.按照權利要求1所述的乳酸菌thyA基因缺失突變株，其特征在于，是利用Cre／lox位點特異性重組系統，使干擾素表達框與thyA基因發生置換而獲得的；或者是利用Cre／lox位點特異性重組系統將thyA基因敲除而獲得的。

7.按照權利要求5所述的信號肽序列，其特征在于，是如下1)或2)的核苷酸序列：

1)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列

2)與序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列。

8.按照權利要求5所述的錨定子序列，其特征在于，是來自于以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-motifcell?wall?anchor?domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下：

YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、YP_005873877、YP_005873931、YP_005873973、YP_005874035、YP_005861438等。