[發(fā)明專利]綿羊毛囊特異性表達啟動子片段的分離及表達模式鑒定

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210489304.X
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103421782A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余梅;柳廣斌;趙書紅;李新云;陳若男;李小平;曹建華;李長春;朱猛進
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到綿羊毛囊特異性表達啟動子片段的分離克隆及表達模式鑒定。

背景技術(shù)

啟動子（Promoter）是基因的重要組成部分，是指一段能使基因進行轉(zhuǎn)錄的脫氧核糖核酸（DNA）序列。啟動子通常位于基因的上游，能夠被核糖核酸（RNA）聚合酶，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識別并與之結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物區(qū)域，從而起始基因轉(zhuǎn)錄。在真核生物中，根據(jù)啟動子的作用方式及功能的不同可分為3種類型：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、及組織特異型啟動子。在組成型啟動子的調(diào)控下，基因的表達恒定在一個水平上，具有連續(xù)性，不呈現(xiàn)時空特異性，亦不受外界因素的誘導(dǎo)；誘導(dǎo)型啟動子需在某些特定的物理或化學(xué)信號刺激下，啟動或大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平；組織特異性啟動子則能夠調(diào)控基因在某些特定的器官或組織表達，且普遍具備發(fā)育調(diào)控特性。因為組織特異性啟動子具有調(diào)控基因表達時空性的特點，所以此類啟動子可以在生物工程中，用于實現(xiàn)外源基因表達的靶向性，減少機體能量和物質(zhì)的損耗及外源基因隨意表達對機體代謝活動的影響。也正因為如此，組織特異性啟動子對基因工程有著重要的意義。

在真核細胞中利用基因工程技術(shù)構(gòu)建多種真核表達系統(tǒng)進行外源基因的表達已是一項常用的技術(shù)。CMV及SV40啟動子是現(xiàn)階段基因工程中應(yīng)用較為廣泛的啟動子，兩者均可以攜帶外源基因，并在幾乎所有類型的細胞中高效表達。但由于這類啟動子不具備靶向調(diào)控基因表達的能力，因此往往會造成轉(zhuǎn)基因個體的正常生長發(fā)育的異常而達不到實驗?zāi)康?。但組織特異性啟動子可以很好的解決了這一難題，它可以控制外源基因在特定的組織或細胞類型中的表達，而不對其他組織的發(fā)育造成影響，因此組織特異性啟動子越來越受到了科學(xué)家的青睞。但是從目前在植物及動物中獲得的組織特異性啟動子中分析發(fā)現(xiàn)，普遍存在特異性不是很高；數(shù)目較少；活性低等問題。這些極大的限制了組織特異性啟動子在基因工程中的應(yīng)用。

本發(fā)明以綿羊為研究材料。綿羊是我國重要的經(jīng)濟動物之一，是牧民賴以生存的重要經(jīng)濟來源，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)總值的重要組成部分。毛用性狀，是綿羊的主要經(jīng)濟性狀之一，提高改善這一個經(jīng)濟性狀，可直接提高羊的生產(chǎn)性能。利用基因工程技術(shù)對綿羊毛用狀經(jīng)濟性狀進行改良，是提高羊經(jīng)濟價值，增加牧民經(jīng)濟收入，提高人們生活水平的高效手段。本發(fā)明就是解決目前綿羊毛囊組織特異性啟動子數(shù)目不足的問題，分離克隆并鑒定了一個綿羊毛囊特異表達啟動子片段，為利用基因工程技術(shù)改良綿羊毛用狀經(jīng)濟性狀提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有可用于綿羊基因工程研究的組織特異表達啟動子數(shù)目不足，從藏綿羊基因組中分離克隆并鑒定出一個具有毛囊組織表達特異性的啟動子，有望將此啟動子用于綿羊的基因工程改良，利用克隆得到的啟動子片段構(gòu)建了sKAP11.1p-GFP真核表達載體，并在啟動子后插入了ZsGreen1綠熒光報告基因。將構(gòu)建好的載體利用原核顯微注射的方法整合到轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中，在個體水平上驗證了該啟動子的表達活性和組織特異性，為日后利用該啟動子奠定了基礎(chǔ)。

實現(xiàn)本發(fā)明任務(wù)的技術(shù)方案如下所述：

1.組織特異性表達基因驗證：采集藏綿羊包括毛囊、皮膚、心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、皺胃、小腸、大腸、淋巴（腸系膜）、脂肪、肌肉、睪丸、卵巢在內(nèi)的16種組織。提取這些組織的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）驗證候選基因KRTAP11.1在各組織中的表達情況。結(jié)果證明KRTAP11.1只在毛囊和皮膚中有表達，通過原位雜交實驗進一步驗證發(fā)現(xiàn)，KRTAP11.1基因只在毛干中表達，是一種毛囊特異表達基因。

2.啟動子克隆及載體構(gòu)建：通過特異性引物，從藏綿羊基因組上擴增得到5954KB大小的啟動子區(qū)域片段，命名為sKAP11.1p。并將該啟動子區(qū)域連接入無啟動子的pZsGreen1-1綠熒光蛋白報告載體的啟動子區(qū)域中，將構(gòu)建好的載體命名為sKAP11.1p-GFP。

3.啟動子表達模式驗證：利用顯微原核注射技術(shù)制作轉(zhuǎn)基因小鼠，將線性化的sKAP11.1p-GFP載體序列整合到轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。待陽性小鼠4周齡時，采集小鼠毛發(fā)、皮膚、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、舌、睪丸、腦組織，提取RNA。經(jīng)表型觀察及RT-PCR驗證ZsGreen1基因只在小鼠毛發(fā)中表達，證明sKAP11.1p啟動子在哺乳動物體內(nèi)具有活性，且為毛囊組織特異性表達啟動子。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：