[發明專利]一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法

有效

• 申請號: 201210488906.3
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN102925535A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 吳意珣;陳博彥;盧英華;鄭雪松;池小琴
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/34;G01N27/447;C12R1/37
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將奇異變形桿菌（Proteus?hauseri）培養后，第1次離心，吸取部分上清得胞外蛋白，沉淀的菌體去離子水重新懸浮菌體后第2次離心，再懸浮，如此反復3次洗滌的菌體，即得全細胞，取洗滌后的部分菌體經超聲破碎后第3次離心，收集上清可得到胞內蛋白；

2）十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離胞外蛋白和全細胞蛋白：將30μL樣品與10μL四倍蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于100℃加熱5min，點樣后進行電泳分析，以0.025%考馬斯亮藍溶液染色1h，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，最后拍照記錄實驗數據；

3）切割蛋白電泳膠片上蛋白分子量介于30~65kDa，胞外蛋白目的條帶需肉眼能夠清晰看到的膠條，胞內蛋白目的條帶取顏色最深的膠條，置于干凈的離心管中，加去離子水浸泡備用；

4）用胰酶酶解法處理目的膠條后，樣品經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALTI-TOF-MS/MS)分析得到相應的肽質指紋圖譜，然后搜索Mascot數據庫鑒定蛋白質身份，將數據與美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行對比后確定蛋白身份；

5）將所得蛋白質信息及NCBI數據庫設計漆酶和孔蛋白基因的引物：

(1)5'ATGCCGCTGTGGCTGGA；

(2)5'TTTAATCCAGATCAGGGTTGCC；

(3)5'ATGATGAAACGCAATCTG；

(4)5'TAATTGATAAGTCAGACCC；

利用菌落PCR技術分別對兩功能性基因進行擴增；

6）將所擴增的基因片段連接于pMD-19T載體，進行基因測序；

7）所得核酸序列利用VectorNTI?10.0軟件翻譯成氨基酸序列，與相近物種彭氏變形桿菌漆酶和孔蛋白氨基酸序列進行對比；

8）將經前培養的奇異變形桿菌接種于LB液體培養基培養，分別添加不同濃度的硫酸銅溶液進行誘導培養，培養至24h收獲菌體，將菌體洗滌兩次后，在pH?3.0以2mmol/LABTS為底物，測全細胞及胞內漆酶酶活；

9)利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌全細胞，經考馬斯亮藍溶液染色后，比較差異蛋白；

10)利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析比較添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌胞內蛋白條帶，將30μL樣品與10μL非變性蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于冰上冰浴5min，點樣后進行電泳分析，整個過程電泳槽置于冰水混合物中，將電泳完成后的凝膠取出，以2mmol/L,pH?3.0的ABTS溶液浸泡凝膠,放入37℃的反應槽中搖動10min取出,即可以見到有深綠色的條紋為漆酶酶活所在處，進行第1次拍照記錄實驗數據；再將膠片重新以0.025%考馬斯亮藍溶液染色1h，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，進行第2次拍照記錄實驗數據。

2.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟1）中，所述奇異變形桿菌（Proteus?hauseri）已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.6746。

3.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟1）中，所述培養的時間為16h。

4.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟1）中，所述第1次離心的條件為8000rpm離心10min。

5.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟1）中，所述第3次離心的條件為14000rpm離心5min。

6.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟2）中，所述四倍蛋白上樣緩沖液的配方為：（0.8~1）g十二烷基磺酸鈉，（2.5~2.6）mL?β-巰基乙醇，（2~2.2）mL?Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的pH?6.8，5mL甘油，5mg溴酚藍。

7.如權利要求1所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟8）中，所述前培養的時間為12h。