[發明專利]一種來源于大腸桿菌的離子通道基因及其抗鹽性應用

無效

• 申請號: 201210488614.X
• 申請日: 2012-11-15
• 公開（公告）號: CN103805614A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 蔣海燕;薛永;殷浩;周惠;伍光彩;張楊
• 申請（專利權）人: 無錫柏歐美地生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/84;A01H5/00;C12R1/19
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技術領域

本發明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于大腸桿菌的離子通道基因的序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物耐鹽能力得到提高。

背景技術

鹽漬化土壤是廣泛分布的不利于植物生長的一種土地，鹽分脅迫嚴重影響著植物的正常生長發育。土壤鹽堿化問題引起了世界各地學者的日益關注，成為現代土壤學研究的熱點。所謂鹽土是指土壤飽和提取液中電導率(EC)高于4ds/m，并且可交換性鈉百分數(ESP)的含量低于15％的土壤，這些土壤的pH一般為中性偏堿，當ESP高于15％、pH大幅上升時的鹽土又稱為鹽堿土。鹽堿土在陸地生態系統上分布廣泛，全世界鹽漬土面積約10億公頃。在全球的干旱和半干旱地區，約有50％的灌溉土地受到鹽堿化的影響，區域內的非灌溉土地同樣會發生鹽堿化。在我國從濱海到內陸，從低地到高原都分布著不同類型的鹽堿土壤，鹽漬土面積約3460萬公頃，鹽堿化耕地760萬公頃，即近1/5耕地發生鹽堿化。

人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始，其次研究植物在各種逆境下產生的生理生化、生態變化和生理調節機制，最后發展到分子水平，進一步探討植物對不同逆境的感應、信號傳導、基因表達與調控、蛋白質組裝和細胞膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應的分子機理和研究人工調控的生物技術等方面展示出良好前景。

抗鹽能力因種而異，抗鹽性強的植物原生質膜具有極低的透性，在同種鹽漬條件下，吸收鹽類明顯少于抗鹽弱的品種，在一定程度上加強了拒鹽的作用。所以可利用生理生化指標鑒定、組織培養、轉基因等技術培育新的抗鹽作物品種，使其適應鹽堿土環境

本項發明利用PTDS法合成了來源于大腸桿菌的離子通道基因，將該基因轉化擬南芥，進而提高了轉基因擬南芥的抗鹽能力，該基因對于培育植物抗鹽的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現實意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于將一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的耐鹽性的功能。

一種來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示。

所述來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2長1650bp，編碼的氨基酸549個。

所述來源于大腸桿菌的離子通道基因ENHX2通過農桿菌介導轉入擬南芥，應用于植物耐鹽性。

所述來源于大腸桿菌的離子通道基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟：

1)ENHX2的人工合成

依照PTDS(PCR-based?two-step?DNA?synthesis，PTDS)方法進行源自大腸桿菌的離子通道基因進行化學合成，在保持ENHX2基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成了ENHX2基因。

2)ENHX2農桿菌雙元載體的構建

ENHX2基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在pCAMBIA-1301載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基因的表達單元，這有利于轉基因的穩定遺傳；在外源基因的表達單元內，我們在目的基因的兩側導入了BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355啟動子+TMV?omega?leader?sequence控制

3)電擊法轉化農桿菌

參照MicroPulser^TM?Electroporation?Apparatus?Operating?Instructions?andApplication?Guide(BIO-RAD公司)制備農桿菌GV3101感受態.并且將構建好的農桿菌雙元載體經電擊法轉入到農桿菌中。

4)農桿菌介導轉化擬南芥

利用蘸花法將構建好的農桿菌轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3～5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22℃培養室，低光強度下生長24小時，即可正常培養。生長約兩個月后，收集種子，4℃冰箱貯存待用。

5)擬南芥轉化植株種子的篩選

將得到的種子進行篩選，包括GUS組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢測得到轉入ENHX2基因的擬南芥。

6)轉基因擬南芥耐鹽性驗證